地钱体外诱变条件及AUX1/AP2L1遗传转化研究

摘要

地钱(Marchantia polymorpha L.)属于苔藓植物，是一种新兴的模式植物，其繁殖方式有两大类，一是有性生殖：孢子；二是无性繁殖：叶状体或胞芽。地钱具有易于培养、周期短、分布广泛等优点，可作为揭示无性繁殖发育机制的模型，但目前胞芽的发育分子调控机制尚不清楚。为了进一步了解胞芽发育的分子调控机制，本实验以地钱胞芽为研究对象，通过使用70%酒精和0.1%NaClO溶液对胞芽进行不同时间的消毒处理以及比较室外和组培胞芽的生长情况，以获得胞芽最佳的消毒处理和胞芽适宜的组培条件，建立地钱的离体培养体系。利用EMS和5-BrU两种诱变剂处理胞芽，筛选出最佳诱变浓度与处理时间的组合，建立地钱的体外诱变体系。利用过表达技术和CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得转基因植株，以探讨MpAUX1和MpAP2L1基因在地钱中的生物学功能。本研究可为用化学诱变剂诱变地钱胞芽提供参考，为阐明地钱胞芽发育的分子机制提供一定的科学依据，同时也为进一步探讨高等植物与低等植物在无性繁殖调节机制上的异同奠定基础。　　主要研究结果如下：　　(1)使用70%酒精和0.1%NaClO溶液对胞芽进行不同时间的消毒处理，最终获得最佳的消毒处理为：0.1%NaClO溶液消毒60s。与室外相比，胞芽更适合在1/2B5培养基(pH值5.5-5.8)、温度22℃、光周期16h/8h(昼/夜)的组培条件下培养。　　(2)利用EMS和5-BrU两种化学诱变剂处理胞芽。胞芽在EMS诱变处理下，萌发受到不同程度的抑制。EMS浓度越高、处理时间越长，抑制作用越强。最终确定EMS诱变胞芽最佳的筛选浓度和时间组合为0.30%处理4h，并获得与对照植株表型不一致的变异植株。胞芽在5-BrU诱变处理下，生长受到不同程度的抑制，浓度越高抑制作用越强，但不足以造成胞芽死亡。　　(3)成功克隆了MpAUX1和MpAP2L1基因，并将其插入到植物表达载体pCAMBIA1300中，构建了p1300-GUS-MpAUX1和p1300-GUS-MpAP2L1过表达载体。将MpAUX1基因插入到植株表达载体pBI121中，构建了pBI121-GUS-MpAUX1过表达载体。　　(4)根据目标基因MpAUX1和MpAP2L1的CDS序列信息，分别设计了一对靶位点，将设计的gRNA片段插入到CRISPR/Cas9载体中，成功构建了p1300-Cas9-MpAUX1和p1300-Cas9-MpAP2L1敲除载体。　　(5)使用浇注法和混培法对胞芽进行头孢霉素和潮霉素耐受性试验。在浇注法中，头孢霉素浓度变化对胞芽无明显影响。潮霉素对胞芽最佳的筛选强度为100μg/mL筛选2-3周。在混培法中，头孢霉素浓度在2mg/mL时，胞芽全部死亡，表明在混培阶段不能超过此浓度进行筛选。获得潮霉素对胞芽的最佳的筛选强度为5μg/mL筛选7-8周或10μg/mL筛选2-3周。相比浇注阶段，头孢霉素和潮霉素在混培阶段对胞芽的影响更大。　　(6)将构建成功的过表达载体p1300-GUS-MpAUX1、p1300-GUS-MpAP2L1、pBI121-GUS-MpAUX1以及敲除载体p1300-Cas9-MpAUX1、p1300-Cas9-MpAP2L1导入地钱胞芽中，经组织培养获得p1300-GUS-MpAUX1转化植株10株；p1300-GUS-MpAP2L1转化植株7株；p1300-Cas9-MpAUX1转化4株，p1300-Cas9-MpAP2L1转化15株。经鉴定，均为假阳性。将过表达载体pBI121-GUS-MpAUX1导入地钱中，成功获得了转基因植株。

目录

第一章 文献综述

1.1 地钱

1.2 胞芽发育的分子机制

1.3 化学诱变

1.4 基因编缉技术

1.5 研究目的及意义

1.6 技术路线

第二章 地钱离体培养体系的建立

2.1 实验材料及主要试剂

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 地钱体外诱变体系的建立

3.1 实验材料及主要试剂

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第四章 基因克隆及过表达载体构建

4.1 实验材料及主要试剂

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第五章 CRISPR/Cas9载体的构建

5.1 实验材料及主要试剂

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

第六章 遗传转化

6.1 实验材料及主要试剂

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

6.4 讨论

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 不足

7.3 展望

参考文献

附录

致谢

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