倍半萜内酯brevilin A抗甲型流感病毒活性研究

摘要

研究背景和目的　　甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)是呼吸道感染的重要病原体，不仅引起季节性流感，还引起流感大流行。IAV容易发生抗原变异，导致新型流感病毒的产生，并对人类健康构成全球性威胁。接种疫苗能有效的预防和控制流感，但其有效期短，效价低，因此，抗病毒药物是治疗流感的重要选择。目前，食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)已批准三种类型的抗病毒药物用于预防和治疗流感，但是耐药病毒株限制了抗流感病毒药物的防治效果，因此，迫切需要开发具有新颖作用机制的抗流感药物。　　前期研究表明，中药鹅不食草的倍半萜内酯brevilinA在体外具有较好的抑制A/PR/8/34H1N1(PR8)活性。本论文在前期研究基础上进一步研究brevilinA的体内抗流感病毒效果、其抗病毒谱和抗病毒作用机制。　　实验方法和结果　　首先，我们构建流感病毒PR8感染小鼠模型，检测给予brevilinA后对感染小鼠的体重及存活率的影响，结果表明，brevilinA显著改善小鼠的体重并提高存活率至50%(病毒对照组小鼠死亡率为100%)。　　然后，我们采用空斑减数实验检测了brevilinA对几种IAV病毒株的体外抑制作用，结果显示brevilinA可以显著抑制不同的IAV亚型，对PR8、A/FM/1/47H1N1(FM1)、A/HongKong/498/97H3N2(HK498)和A/chicken/Guangdong/1996H9N2(Gd1996)的EC50分别为2.96±1.10、1.60±1.14、3.28±1.09和2.07±1.12μM。为了评估brevilinA对各种流感病毒或病毒滴度的生长曲线的影响，通过空斑实验测定多个复制周期内不同时间点的病毒滴度，我们发现brevilinA对高低滴度IAV不同亚型子代病毒的产生均有显著抑制效果，最多降低约10倍。采用空斑实验和免疫荧光法检测brevilinA作用于流感病毒哪个复制阶段，结果显示brevilinA主要作用于IAV复制的4-8hpi。于是我们采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验进一步分析了brevilinA对病毒信使RNA(Messenger RNA， mRNA)、病毒RNA(Viral ribonucleic acid，vRNA)和互补RNA(Complementary RNA，cRNA)合成的影响，与病毒对照组相比，brevilinA处理组中vRNA显著降低。我们同时进行了免疫印迹实验(Western blotting)以检测brevilinA对病毒蛋白表达的影响，结果显示，与病毒对照组相比，brevilinA处理组中，M1、M2、NS1和NS2蛋白水平有不同程度的降低，其中，M2和NS2蛋白表达降低至70%。而M1、M2、NS1和NS2蛋白是由M和NSmRNA的可变剪接而翻译产生。接下来我们通过RT-qPCR实验检测了brevilinA对M1、M2、NS1和NS2mRNA合成的影响，与病毒对照组相比，brevilinA处理组中，M1、M2、NS1和NS2mRNA水平有不同程度的降低，M2mRNA表达水平降低最显著，减少约55-60%。我们接下来进行了激光共聚焦免疫荧光实验，以评估brevilinA对病毒核糖核蛋白复合物(Viral ribonucleoprotein，vRNP)出核的影响，结果显示，与病毒对照组相比，brevilinA影响IAVvRNP的出核。　　结论　　BrevilinA在体内、外具有抗IAV活性。作用机制研究表明，brevilinA在三个方面抑制流感病毒复制，包括vRNA合成、病毒mRNA的表达以及由M和NS片段编码的蛋白以及vRNPs的核输出。这些结果为探索与brevilinA具有相似结构的倍半萜内酯作为潜在的抗流感治疗奠定了基础。

目录

声明

第一章 前言

1.1 流感病毒的研究概况

1.1.1 流感病毒的结构和分类

1.1.2 流感病毒的命名

1.1.3 流感病毒的宿主范围

1.1.4 流感病毒的复制周期

1.1.5 流感病毒的致病性

1.1.6 流感病毒的预防和治疗

1.2 Brevilin A的研究概况

1.3 立题依据

1.4 课题研究路线图

第二章 Brevilin A体内抗甲型流感病毒活性研究

2.1 实验材料

2.1.1 病毒和动物

2.1.2 化合物

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要耗材

2.1.5 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 流感病毒的扩增

2.2.2 半数致死量（Median lethal dose，LD50）的测定

2.2.3 Brevilin A体内抗流感病毒活性实验

2.2.4 统计分析软件

2.3 实验结果

2.3.1 流感病毒PR8对BALB/c小鼠LD50的测定

2.3.2 Brevilin A体内抗流感病毒活性评价

2.4 本章小结与讨论

第三章 Brevilin A体外抗甲型流感病毒活性研究

3.1 实验材料

3.1.1 细胞和病毒

3.1.2 化合物

3.1.3 主要试剂

3.1.4 实验仪器

3.1.5 常用溶液的配置

3.1.6 实时荧光定量PCR引物

3.2 实验方法

3.2.1 细胞复苏

3.2.2 细胞传代

3.2.3 细胞冻存

3.2.4 病毒扩增及其血凝效价的测定

3.2.5 空斑实验检测流感病毒的滴度

3.2.6 CCK8法检测brevilin A和利巴韦林对细胞的毒性

3.2.7 空斑减数法检测brevilin A和利巴韦林对流感病毒的抑制作用

3.2.8 空斑实验检测brevilin A对流感病毒生长曲线的影响

3.2.9 空斑实验和免疫荧光法检测brevilin A作用于流感病毒哪个复制阶段

3.2.10 实时荧光定量PCR检测brevilin A对流感病毒RNA的影响

3.2.11 免疫印迹实验检测brevilin A对流感病毒蛋白的影响

3.2.12 激光共聚焦免疫荧光实验检测brevilin A对流感病毒vRNP核输出的影响

3.2.13 数据处理

3.3 实验结果

3.3.1 细胞状态和细胞病变图

3.3.2 不同亚型IAV的血凝效价

3.3.3 不同亚型IAV的滴度

3.3.4 Brevilin A对不同亚型IAV均有抑制作用

3.3.5 Brevilin A对不同亚型IAV生长曲线的影响

3.3.6 Brevilin A作用于流感病毒基因组复制和翻译阶段

3.3.7 Brevilin A抑制流感病毒vRNA的合成

3.3.8 Brevilin A抑制流感病毒M和NS蛋白的表达

3.3.9 Brevilin A抑制流感病毒M和NS mRNA的表达

3.3.10 Brevilin A抑制流感病毒vRNP出核

3.4 本章小结与讨论

第四章 全文总结与展望

参考文献

主要缩略词表

在校期间参与发表论文

致谢