人成纤维细胞生长因子2纳米抗体对FGF-2稳定性的影响

摘要

蛋白和多肽类药物具有专一性强、毒性低等优点，使其近年来在医药领域成为研究热点。由于蛋白和多肽类药物存在稳定性差、保存条件要求高等问题，因此，解决蛋白类药物的稳定性问题对药物的广泛应用十分关键。FGF-2作为人体内重要的细胞因子，存在已上市的蛋白药物，也具有其他适应症应用潜能，然而FGF-2极易产生聚沉反应而失活的特性一直是其应用中的瓶颈。本研究旨在通过抗FGF-2的纳米抗体4(Nanobody4, Nb4)与其结合的方式，在不影响其生物学活性的前提下，增强其稳定性。运用高密度原核细胞发酵和Ni-RTA亲和层析纯化技术获得纯度达95%以上的Nb4和抗FGF-2的纳米抗体6(Nanobody6, Nb6)蛋白。通过摇瓶发酵和CM-SephadexFastFlow离子交换层析以及Heparin-sepharoseCL-6B亲和层析得到FGF-2蛋白，制成0.2mg/mL的FGF-2与Nb4混合物(FGF-2+Nb4)和对照组0.2mg/mLFGF-2，对该两类样品在不同温度(4℃、25℃、37℃、40℃)、pH(5、7、9、11)、放置时间(1到4周)、蛋白保护剂与变性剂、转速(500rpm、1000rpm)条件下处理。运用WesternBlotting和ELISA双抗夹心法检验，再利用细胞划痕、细胞增殖实验进行验证。发现FGF-2在高温、强碱等条件下极不稳定，Nb4随着FGF-2放置时间的延长、温度的升高以及碱性环境变强的条件下对FGF-2的保护作用增强，同时发现，当1mol/L蔗糖作为辅助蛋白保护剂时的FGF-2+Nb4组效果最好，即1mol/L蔗糖和Nb4可组合作为蛋白保护剂备选物。

目录

声明

第一章 前言

1.1 成纤维细胞生长因子2概述及其应用现状

1.2 与蛋白质稳定的相关因素

1.2.1 物理因素

1.2.2 化学因素

1.3 增强蛋白质稳定性的途径

1.3.1 蛋白保护剂

1.3.2 化学修饰

1.3.3 改变蛋白质制剂剂型

1.4 纳米抗体

1.4.1 纳米抗体的结构特性

1.4.2 纳米抗体的生化特性

1.5 药物稳定性试验

1.5.1 影响因素试验

1.5.2 加速试验

1.5.3 长期试验

本课题研究目的及意义

技术路线

第二章 纳米抗体高密度发酵和纯化以及成纤维细胞生长因子2的表达纯化

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂

1.1.2 主要仪器与耗材

1.1.3 主要试剂配制

1.2 实验方法

1.2.1 BL21感受态制备

1.2.2 pET-22b-FGF-2重组质粒的构建

1.2.3 培养条件优化—FGF-2小量表达

1.2.4 SDS-PAGE 分析

1.2.5Western Blotting实验

1.2.6 菌种保存

1.2.7 FGF-2的摇瓶发酵

1.2.8 Nb4和Nb6的高密度细胞发酵培养

1.2.9 FGF-2纳米抗体（Nb4和Nb6）纯化

1.2.10 FGF-2的纯化

1.2.11 总蛋白浓度测定（BCA法）

1.2.12 Nb4对FGF-2亲和力检测

1.3 实验结果

1.3.1 重组质粒pET-22b-FGF-2的构建

1.3.2 FGF-2的摇瓶表达和纯化

1.3.3 Nb4和Nb6的高密度原核细胞发酵及表达

1.3.4 Nb4和Nb6的纯化

1.3.5 FGF-2与Nb4的亲和力检测

1.4 讨论

第三章 Nb4对FGF-2在免疫印迹和酶联免疫水平上稳定性影响的初探

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂

1.1.2 主要仪器与耗材

1.1.3 主要试剂配制

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理：

1.2.2Western Blotting实验

1.3 实验结果

1.3.1 FGF-2和FGF-2+Nb4在1X PBS条件下灰度分析

1.3.2 FGF-2和FGF-2+Nb4在添加蛋白保护剂和变性剂的灰度分析

1.3.3 FGF-2和FGF-2+Nb4在不同搅拌转速时的灰度分析

1.3.4 ELISA法测FGF-2浓度标准曲线的建立

1.3.5 FGF-2和FGF-2+Nb4的ELISA分析

1.4 本章讨论

第四章 Nb4对FGF-2在细胞水平上稳定性影响的研究

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂、耗材与仪器

1.1.2 试剂配制

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的复苏、培养与冻存

1.2.2 BALB/C-3T3细胞划痕实验

1.2.3 FGF-2对BALB/C-3T3的细胞增殖实验

1.2.4 FGF-2+Nb4和FGF-2对BALB/C-3T3的细胞增殖实验

1.3 实验结果

1.3.1 FGF-2对BALB/C-3T3增殖效果的浓度范围测定

1.3.2 BALB/C-3T3划痕实验

1.3.3 不同溶剂的FGF-2+Nb4对BALB/C-3T3细胞的增殖效果

1.4 本章讨论

第五章 全文总结与展望

1.1 全文总结

1.2 创新点

1.3 展望

参考文献

英文缩写表

硕士期间发表论文

致谢