NF-κB信号通路在小鼠次级卵泡向有腔卵泡转化中的作用

摘要

实验目的：　　女性长期服食非甾体类抗炎药物，会造成排卵功能障碍。这暗示了过度抑制卵巢炎症信号，可能会损害卵巢卵泡发育的正常调控机制。NF-κB作为经典的炎症信号通路，它参与一系列细胞内正常或非正常的生理途径。然而，NF-κB在哺乳动物卵泡发育中的生理作用，仍然是不清楚的。因此，本文将主要探索NF-κB信号对卵泡发育的影响。　　实验方法：　　本文利用了knock-in转基因技术，定点突变了NF-κB亚基p50上的一个保守半胱氨酸，使其突变为丝氨酸，从而大大增强了NF-κB核因子的DNA连接活性，建立了NF-κB激活小鼠模型。收取正常组和转基因组的小鼠卵巢，分析卵巢表型差异。后进一步进行石蜡切片，并通过形态学染色、免疫荧光、Q-PCR和Western-blot等方法，全面分析各级卵泡的差异，并检测与卵巢细胞增殖、凋亡和分化密切相关的各个重要因子的表达水平。在体外实验中，我们分别往COV434颗粒细胞株中加入了不同浓度的LPS和Bay11-7082(NF-κB抑制剂)，对NF-κB信号进行不同的干扰，并检测颗粒细胞的增殖、凋亡与分化的水平。　　实验结果：　　结果显示，当激活小鼠NF-κB内源性信号后，转基因组小鼠卵巢的重量与二维面积较正常组无明显差异，但卵巢表面出现了较多的血管分布。各级卵泡数目统计发现，转基因组的有腔卵泡数目增多，次级卵泡数目减少，并且与有腔卵泡发育密切相关的类固醇合成酶相关基因Cyp11a1、Cyp19a1的表达均出现上调。此外，在转基因组颗粒细胞中与分化密切相关的FSHR和LHR的表达较正常组均出现明显上调。与细胞增殖相关的Ki67和PCNA的表达也都出现了上调趋势。然而，在转基因组中，我们发现了闭锁卵泡数目与正常组相比明显减少，并且细胞凋亡相关因子如Fas、Fasl和c-caspase3的表达均有不同程度的减弱。在体外实验中，经LPS处理COV434的激活组的增殖水平提升，凋亡信号受到抑制，且与颗粒细胞后期分化密切相关的FSHR的表达也出现了上调。反之，经Bay11-7082处理后的NF-κB抑制组，其颗粒细胞增殖受到抑制，凋亡信号增强，FSHR的表达也受到了明显的抑制。　　实验结论：　　综上结论，NF-κB信号很可能参与了正常的卵泡发育调控，其主要作用于次级卵泡向有腔卵泡转化的阶段。激活NF-κB内源性信号，能促进卵巢颗粒细胞的增殖与分化，抑制其细胞凋亡，从而加快次级卵泡向有腔卵泡的转化和抑制卵泡的闭锁。这个过程很可能由与促进了FSHR的表达，并抑制了Fas/Fasl的上游凋亡途径有关。

目录

声明

1前言

1.1卵巢的结构与功能

1.2 卵泡的基本结构、分级与发育进程

1.3卵泡闭锁与颗粒细胞的凋亡

1.4调控卵泡发育的信号机制

1.5 NF-κB家族的组成和功能作用

1.6 NF-κB对卵巢颗粒细胞的影响

1.7 研究的目的和意义

2实验材料与实验方法

2.1实验动物

2.2主要试剂和仪器

2.3重要的试剂配制

2.4 实验方法

2.5 统计学分析

2.6 研究思路

3实验结果

3.1 NF-κB在卵泡发育中的原位表达谱

3.2 NF-κB1C59S小鼠模型的构建与鉴定

3.3 小鼠卵巢中NF-κB信号激活的验证

3.4 NF-κB激活会加快次级向有腔卵泡的转化，并增强FSHR的表达

3.5 NF-κB激活促进了次级卵泡和有腔卵泡颗粒细胞的增殖

3.6 NF-κB的激活抑制了卵泡的闭锁与颗粒细胞的凋亡

3.7 体外激活颗粒细胞的NF-κB信号，能促进颗粒细胞生长

3.8 抑制NF-κB信号会影响颗粒细胞增殖凋亡与FSHR的表达水平

3.9 NF-κB信号通路会参与调控小鼠卵泡的发育

讨论

总结

参考文献

英文缩略词表索引

攻读硕士学位期间发表论文清单

致谢