再生障碍性贫血病人外周血T细胞共刺激分子CD27表达和功能特点研究

摘要

目的：再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)是一种T细胞免疫异常介导的自身免疫性疾病，其中异常T细胞活化与AA中T细胞稳态的不平衡有很大关系。我们前期发现AA中CD3ζ基因表达及其调控机制异常。同时，T细胞活化第二信号分子CD28和CTLA-4表达异常。本研究将进一步分析AA中第二信号分子CD27分子的表达和功能变化特点，为深入分析AA中异常的T细胞活化机制提供新的研究资料。　　方法：①利用实时荧光定量PCR检测健康人和AA病人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中CD137，GITR，HVEM，OX40，ICOS和CD27分子mRNA表达水平；②利用流式细胞术检测健康人和AA病人外周血CD27和CD70在不同T细胞亚群的比例以及穿孔素和颗粒酶B在CD8+CD27+T细胞的比例；③利用ELISA检测健康人和AA病人血浆中可溶性CD27(soluble CD27，sCD27)的水平；④利用流式细胞术检测健康人和AA病人外周血CD3+/CD4+/CD8+T细胞上不同活化/分化阶段T细胞的比例、CD45RO-CD27+T细胞上初始T细胞(na?veTcell，TN)和记忆干性T细胞(stem memory T cell，TSCM)的分布情况以及早期和晚期分化阶段T细胞上效应记忆T细胞(effector memory T cell，TEM)和中央记忆T细胞(central memory T cell， TCM)的分布情况；⑤利用流式细胞术检测健康人和AA病人PBMCs活化刺激后的CD4+/CD8+T细胞中不同活化/分化阶段T细胞上IFN-γ+T细胞的比例；⑥利用流式细胞术检测健康人和AA病人外周血中不同活化/分化阶段T细胞上增殖和活化状态。　　结果：①AA病人PBMCs中OX40，ICOS和CD27基因mRNA的相对表达水平(中位数分别为：0.029%，0.153%和0.609%)显著高于健康人(中位数分别为0.008%，0.083%和0.105%)；②VSAA，SAA和NSAA病人外周血CD4+CD27+T细胞比例(中位数分别为93.7%，91.3%和94.7%)均显著高于健康人(中位数：87.8%)，VSAA和SAA病人外周血CD8+CD27+T细胞比例(中位数分别为92.4%和81.9%)均显著高于健康人(中位数：68.5%)；③VSAA和NSAA病人外周血CD4+CD70+T细胞比例(中位数分别为1.9%和1.95%)均显著低于健康人(中位数：4.4%)，VSAA和SAA病人外周血CD8+CD70+T细胞比例(中位数分别为1.52%和1.73%)均显著低于健康人(中位数：2.55%)；④VSAA和SAA病人外周血CD8+CD27+穿孔素+T细胞的比例(中位数分别为4.22%和8.55%)显著高于健康人(中位数：3.57%)；⑤VSAA，SAA和NSAA病人血浆中sCD27的水平(中位数分别为76.67U/ml，51.79U/ml和61.17U/ml)显著低于健康人(中位数：92.58U/ml)；⑥AA病人外周血CD3+T细胞晚期和终末期T细胞亚群的比例(中位数分别为5.92%和2.64%)显著低于健康人(中位数分别为9.43%和10.6%)，CD4+T细胞终末期T细胞亚群的比例(中位数：0.67%)显著低于健康人(中位数：2.08%)，CD8+T细胞中CD45RO-CD27+T细胞的比例(中位数：61.35%)显著高于健康人(中位数：43%)，CD8+T细胞晚期和终末期T细胞亚群的比例(中位数分别为4.53%和5.53%)显著低于健康人(中位数分别为10.3%和19.4%)；⑦AA病人外周血CD3+T细胞中TSCM的比例(中位数：4.56%)显著高于健康人(中位数：1.84%)，CD4+T细胞中TSCM的比例(中位数：3.81%)显著高于健康人(中位数：2.61%)，CD8+T细胞中TN和TSCM的比例(中位数分别为50.42%和3.82%)显著高于健康人(中位数分别为31.25%和2.28%)；⑧AA病人CD3+T细胞早期和晚期T细胞亚群的TEM的比例(中位数分别为34.8%和66.1%)均显著低于健康人(中位数分别为46.2%和79.7%)，而TCM的比例(中位数分别为65.2%和33.9%)均显著高于健康人(中位数分别为53.8%和20.3%)，CD4+T细胞早期和晚期T细胞亚群的TEM的比例(中位数分别为15.4%和58.3%)均显著低于健康人(中位数分别为36.1%和76.3%)，而TCM的比例(中位数分别为84.6%和41.7%)均显著高于健康人(中位数分别为63.9%和23.7%)；⑨AA病人外周血CD4+T细胞早期，晚期和终末期T细胞亚群上IFN-γ+T细胞的比例(中位数分别为27.3%，45.3%和50.8%)均显著高于健康人(中位数分别为15.1%，17.3%和12.2%)，CD8+T细胞早期，晚期和终末期T细胞亚群上IFN-γ+T细胞的比例(中位数分别为72.7%，72.8%和78.9%)也显著高于健康人(中位数分别为33.8%，14.1%和17.8%)；⑩AA病人外周血CD4+T细胞早期和终末期T细胞亚群上Ki-67+T细胞的比例(中位数分别为3.15%和3.77%)显著高于健康人(1.83%和1.79%)，CD8+T细胞早期、晚期和终末期T细胞亚群上Ki-67+T细胞的比例(中位数分别为2.61%，4.07%和4.07%)也都显著高于健康人(中位数分别为1.66%，2.47%和1.32%)；?AA病人CD8+T细胞CD45RO-CD27+T细胞亚群上HLA-DR+T细胞的比例(中位数：2.21%)显著低于健康人(中位数：4.36%)；AA病人CD8+T细胞早期T细胞亚群上CD38+T细胞的比例(中位数：22.7%)显著高于健康人(中位数：13.2%)；AA病人CD4+T细胞中CD45RO-CD27+和早期T细胞亚群上CD69+T细胞的比例(中位数分别为0.33%和0.56%)显著低于健康人(中位数分别为0.59%和0.83%)，而CD8+T细胞终末期T细胞亚群上CD69+T细胞的比例(中位数：2.57%)显著高于健康人(中位数：1.39%)；AA病人CD4+T细胞中CD45RO-CD27+、早期、晚期和终末期T细胞亚群上CD25+T细胞的比例(中位数分别为14.65%，66.1%，64%和75.45%)都显著高于健康人(中位数分别为9.95%，32.8%，47.1%和26.4%)。　　结论：①AA病人T细胞的异常活化与OX40，ICOS和CD27三个共刺激信号分子表达异常及失调有关；②AA病人外周血中增加的CD8+CD27+perforin+T细胞和降低的CD8+CD70+T细胞可能是AA病情严重程度的免疫标记物；③AA病人血浆中降低的sCD27水平可能影响了其对T细胞活化的负性调节作用；④AA病人外周血中CD45RO-CD27+T细胞比例的增加和晚期/终末期亚群比例的减少提示AA病人T细胞活化/分化过程免疫稳态失衡；⑤随着T细胞活化/分化的进程，AA病人T细胞增殖和分泌IFN-γ的分泌能力逐渐增强；⑥由HLA-DR，CD38，CD69和CD25介导的AA病人外周血不同活化/分化阶段T细胞的活化状态与健康人有明显的差异。

目录

声明

1 前言

1.1 AA的诊断与治疗

1.2 AA的T细胞免疫异常研究进展

1.3 AA的异常T细胞活化信号研究

1.4 AA中不同记忆T细胞亚群研究

1.5 T细胞活化共刺激信号分子-CD27

1.6研究目的、内容和意义

2 材料和方法

2.1主要实验仪器及耗材

2.2主要试剂

2.3实验方法

2.4统计分析

3 技术路线和实验结果

3.1技术路线3.2实验结果

4 讨论

4.1 AA病人PBMCs中OX40，ICOS和CD27表达异常

4.2增加的CD8+CD27+perforin+T细胞和降低的CD8+CD70+T细胞可能是AA病情程度的免疫标记物

4.3 AA病人外周血不同活化/分化阶段T细胞亚群的情况

4.4 AA病人外周血中不同活化/分化阶段T细胞亚群功能变化的特点

4.5总结与展望

5 结论

参考文献

附录 英文缩略语对照表

硕士研究生期间科研成果

致谢

特别鸣谢