豆薯种子病程相关蛋白SPE16的性质和结构研究细胞凋亡关联蛋白ALG-2的初步晶体学研究

摘要

SPE16是我们在豆薯(Pachyrrhizus erous)种子中新发现的一个单体分子量为16kDa的蛋白.纯化的蛋白经N端氨基酸序列分析显示其与植物病程相关蛋白第十家族PR-10具有很高的同源性.根据N端氨基酸序列及PR-10家族蛋白C端保守序列设计了两个简并引物,迎过RT-PCR和3'full RACE的方法得到了编码这一蛋白的全长cDNA序列,证实了SPE16是病程相关蛋白PR-10的新成员.将此基因克隆到pET15b质粒上并在大肠杆菌中得到表达.活性实验显示,天然和重组的SPE16蛋白都具有明显的类核糖核酸酶活性.我们针对可能参与这种SPE16的类核糖核酸酶活性的三个氨基酸E95、E147、Y149和一个P-loop分别构建了定点突变和缺失突变体.结果发现P-loop和结构上位于C端α螺旋两侧且高度保守的Glu147,Tyr149是与其RNase的活性相关的.我们还发现天然SPE16蛋白有结合非极性的荧光探针分子8-苯氨-1-萘磺酸(ANS)的功能.通过气象悬滴扩散的结晶方法我们得到了不同形式的SPE16蛋白晶体,包括天然SPE16蛋白晶体(SPE16(NT)),SPE16和ANS共结晶的复合物晶体(SPE16(+ANS)).这两种形式的蛋白晶体都收集到了较高质量的数据,并且都已用分子置换方法得到相位,结构已经解析完毕.SPE16晶体一个独立区的两个分子通过C末端α螺旋之间的疏水相互作用形成二聚体.结构模型的总体特征是七个反向平行的β折叠片和N端两个小α螺旋包裹着C末端一个长的α螺旋,并且这3个α螺旋以及β折叠形成了一个Y型疏水空穴.SPE16(+ANS)复合物的结构显示存在于SPE16结构中的Y型疏水空穴和分子表面的疏水区有结合非极性分子的功能,显示SPE16蛋白除了RNase酶活性以外的结合功能.鉴于PR-10蛋白家族的真正功能还没有确定,我们的这些试验结果为揭示这个家族蛋白真正生物学功能提供了新的证据.

目录

致谢

第一部分豆薯种子病程相关蛋白SPE16的性质和结构研究

第一篇背景介绍

第一节植物抗病基因

第二节病程相关蛋白(Pathogenesis-Related Proteins)

第三节PR-10家族蛋白

第四节植物的核糖核酸酶(Plant Ribonuclease)

第二篇豆薯种子病程相关蛋白SPE16的生化性质研究

第一章:豆薯种子病程相关蛋白SPE16的分离纯化和性质研究

第二章豆薯SPE16重组蛋白表达以及突变体的活性研究

第三章天然SPE16蛋白的结合活性研究以及spe16全基因的获得

第三篇SPE16蛋白的晶体结构解析

第一章晶体生长和衍射数据的收集

第二章分子置换法解析SPE16蛋白晶体结构

第三章结构分析与讨论

小结

参考文献

第二部分细胞凋亡关联蛋白ALG-2的初步晶体学研究

摘要

Abstract

第一章简介

第二章ALG-2蛋白的表达纯化和初步晶体学研究

第一节蛋白的表达纯化

第二节ALG-2的初步晶体学研究

参考文献

附录1缩略词表

附录2已发表和待发表的研究论文