阿司匹林通过诱导细胞自噬发挥对冠状动脉内皮细胞功能的保护效应

摘要

血管内皮细胞覆盖于血管内腔表面，对血管内皮功能起保护作用。内皮细胞损伤是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）形成的起始环节，而AS是诸多心脑血管疾病的病理基础。血管内皮功能障碍表现为血管张力增高，外周血管阻力增大，从而加重心脑血管负荷，引起多种心脑血管疾病的发生。预防及改善血管内皮损伤对于逆转AS及防治心脑血管疾病具有重要的临床意义。阿司匹林(Aspirin)作为目前临床上应用最为广泛的心脑血管疾病防治药物，目前已有多项研究证实其不但有卓越的抗血小板作用，而且具有抑制及延缓AS的形成以及显著的血管内皮保护作用。氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxidized-LowDensity Lipoprotein Cholester，ox-LDL)在AS的发生发展过程中起十分重要的作用。ox-LDL可促进泡沫细胞形成，其化学毒性作用于平滑肌细胞，促使平滑肌细胞向内皮层迁移，同时可通过刺激血管内皮细胞促使黏附分子、细胞因子分泌增加，也可抑制内皮细胞产生一氧化氮（nitric oxide，NO）及前列腺素（prostaglandin，PG）。早年研究表明阿司匹林可以通过抑制ox-LDL刺激内皮细胞产生的环氧化酶-2（cycooxygenase-2，COX-2）及细胞间粘附因子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）表达，从而发挥对内皮细胞损伤的保护作用。内皮细胞功能受损的最主要标志是内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性降低，有研究显示阿司匹林可通过对eNOS的直接刺激作用增加内源性NO合成及环磷酸鸟苷的积聚从而防止内皮氧化损伤达到内皮保护作用。　　自噬是细胞对于环境变化的快速反应，对新陈代谢起着重要作用，也可作为一种细胞死亡机制诱导细胞主动死亡。自噬体及自噬溶酶体形成是细胞发生自噬的标志。Beclin-1是首个被认可的介导哺乳动物自噬的基因，蛋白Beclin-1、LC3和P62在调控自噬过程中起重要作用。在自噬的启动阶段，Beclin-1与P13K、Atg14形成三聚体，并不断募集自噬相关蛋白，介导自噬起始；在Atg4作用下，LC3前体被加工成可溶性LC3I，后者在Atg7和Atg3作用下与磷脂酰乙醇胺(PE)连接成为脂溶性的LC3-Ⅱ-PE复合体，参与自噬溶酶体膜的延伸，直到自噬溶酶体形成；定位于细胞质中的P62与经泛素化的蛋白结合后再与LC3-Ⅱ蛋白结合形成复合物，并最终会在溶酶体内降解，在自噬的过程中，P62会不断被消耗，这三个蛋白是检测自噬水平的关键指标。目前已有大量流行病学研究证实阿司匹林可降低消化系统肿瘤的发病率，并有文献报道阿司匹林可通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian targetof rapamycin，mTOR）信号通路抑制小鼠肝癌和肉瘤模型中血管生成并诱导其发生自噬进而抑制肿瘤细胞的生长。内皮细胞作为保护血管功能的屏障，是高血压、高血糖、高血脂等多种危险因素作用的靶点，同时也是多种药物治疗干预的靶器官。目前已有大量的研究证实阿司匹林能改善这些高危因素所致的内皮损伤及延缓动脉粥样硬化的形成，但是其中的机制仍未完全阐明。阿司匹林作为防治心血管疾病的最常用药物，是否能通过诱导内皮细胞自噬从而提高血管内皮细胞功能呢？至今还没有相关的研究进行报道。　　目的：　　本研究的主要目的是研究阿司匹林是否能通过诱导冠状动脉内皮细胞发生自噬对血管内皮细胞功能起保护作用以及相关的机制。　　方法：　　1、阿司匹林是否可诱导人冠脉内皮细胞自噬：利用细胞培养技术培养人冠脉内皮细胞，Western-blot检测不同浓度aspirin对细胞中自噬相关蛋白LC3和P62表达的水平，并利用荧光显微镜观察细胞中自噬体及自噬溶酶体的表达，进一步探讨阿司匹林是否可诱导人冠脉内皮细胞细胞自噬。　　2、阿司匹林诱导细胞自噬与自噬调节基因Beclin-1的关系：设计合成4条siRNA，并评价4条siRNA的干扰效果；利用Western-blot法检测细胞中自噬相关蛋白LC3与Beclin-1蛋白的表达水平，利用荧光显微镜观察细胞中自噬体及自噬溶酶体的表达水平，探讨阿司匹林诱导细胞自噬与自噬调节基因Beclin-1的关系。　　3、研究JNK-pBcl2信号通路在阿司匹林诱导细胞自噬中的作用：利用Western-blot检测不同浓度aspirin溶液对磷酸化蛋白p-JNK、p-JUN及p-Bcl-2表达水平；利用免疫沉淀法评价阿司匹林、Bcl-2与Beclin-1三者之间的关系。　　4、阿司匹林呈浓度依赖的增加内皮细胞eNOS活性：本实验利用Western-blot法检测不同浓度aspirin对细胞中蛋白p-eNOS和eNOS的表达水平，利用NO检测试剂盒检测细胞释放NO的水平，从而评价阿司匹林对冠脉内皮细胞功能的影响。　　5、评价阿司匹林对ox-LDL、AngⅡ、高糖引起的内皮细胞损伤的作用：本实验利用Western-blot法检测aspirin（2.5mM）对ox-LDL（50ug/ml）、AngⅡ（10umol/L）及高糖（25mmol/L）所致的蛋白P-P38及P-NF-κB的表达水平的影响，利用ELISA检测粘附因子sICAM-1、s-VCAM-1表达水平。　　6、阿司匹林对内皮细胞的保护作用是否依赖于自噬调节基因Beclin-1：利用siRNA干扰Beclin-1的表达，Western-blot检测沉默自噬基因Beclin-1表达后aspirin对内皮细胞中蛋白P-P38、P-NF-kB、p-eNOS、LC3、P62的表达水平的影响，以及利用ELISA法及NO检测法检测干扰Beclin-1表达后aspirin对内皮细胞粘附因子sVCAM-1和sICAM-1表达及NO释放水平的影响。　　结果：　　1、阿司匹林诱导冠脉内皮细胞自噬　　本实验中利用Western-blot检测经不同浓度aspirin对冠脉内皮细胞中自噬相关蛋白LC3和P62表达的水平，发现随着aspirin浓度的增加蛋白LC3Ⅱ的表达逐渐增多，而蛋白P62的表达缺逐渐减少，以2.5mM最为明显(P＜0.05)，说明阿司匹林呈浓度依赖性诱导内皮细胞自噬。利用荧光显微镜观察人冠脉内皮细胞成功感染腺病毒GFP-RFP-LC3后细胞自噬体及自噬溶酶体表达水平，结果发现人冠脉内皮细胞中自噬体与自噬溶酶体的数量较对照组明显增多（P＜0.05）。　　2、阿司匹林诱导细胞自噬是Beclin-1依赖的　　利用siRNA技术干扰Beclin-1表达，aspirin（2.5mM）及siRNA处理细胞，Western-blot法检测细胞中自噬相关蛋白LC3与Beclin-1蛋白的表达水平结果显示：si-Beclin-1组与si-NC组相比Beclin-1、LC3的表达明显减少（p＜0.05），aspirin+si-NC组与si-NC组相比较Beclin-1、LC3明显增多（p＜0.05），aspirin+si-beclin-1组与aspirin+si-NC组相比较阿司匹林促进Beclin-1、LC3的表达明显减弱（p＜0.05）；利用质粒转荧光显微镜观察自噬流分析结果提示：aspirin+si-NC组与si-NC组相比较自噬体及自噬溶酶体明显增多（p＜0.05），aspirin+si-beclin-1组与aspirin+si-NC组相比较阿司匹林促进自噬体及自噬溶酶体表达增多的作用明显减弱（p＜0.05），说明阿司匹林诱导的细胞自噬依赖于自噬基因Beclin-1的激活。　　3、阿司匹林通过JNK-pBcl2信号通路诱导细胞自噬　　Western-blot检测不同浓度aspirin对细胞中磷酸化蛋白p-JNK、p-c-JUN、p-Bcl-2的表达水平结果显示随着阿司匹林浓度的增加磷酸化蛋白p-JNK、p-c-JUN及p-Bcl-2表达明显增多，并呈浓度依赖型；随后利用免疫沉淀法评价阿司匹林、Bcl-2、Beclin-1三者之间的关系发现阿司匹林可阻断Bcl-2与Beclin-1的结合，说明阿司匹林可通过JNK-pBcl2信号通路诱导细胞自噬。　　4、阿司匹林呈浓度依赖的增加冠脉内皮细胞eNOS活性　　利用Western-blot检测不同浓度aspirin对冠脉内皮细胞中p-eNOS和eNOS蛋白含量的影响，结果显示在浓度0.315至0.63mM之间，阿司匹林对p-eNOS的影响不明显，在浓度为1.25至5mM时，阿司匹林可明显提高p-eNOS水平（P＜0.05）。其次使用NO检测试剂盒利用酶标仪度检测经不同浓度阿司匹林处理过的冠脉内皮细胞上清液中NO的含量，结果显示在浓度1.25至5mM时随着阿司匹林浓度的增加细胞上清液中NO的浓度也逐渐增加(P＜0.05)。说明阿司匹林呈浓度依赖的提高内皮细胞eNOS活性。　　5、阿司匹林抑制ox-LDL、AngⅡ、高糖引起的内皮细胞损伤　　利用Western-blot检测50ug/ml的氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、10umol/L的血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、25mmol/L的高糖（HG）对冠脉内皮细胞中蛋白P-P38、P-NF-kB的表达的影响，结果显示ox-LDL、AngⅡ及HG可明显增加冠脉内皮细胞中P-P38及P-NF-kB蛋白的表达；利用ELISA法测定细胞中粘附因子sICAM-1和s-VCAM-1的表达，结果显示ox-LDL、AngⅡ及HG可明显增加细胞上清液中sICAM-1和s-VCAM-1的表达；随后加入aspirin（2.5mM）处理冠脉内皮细胞，Western-blot检测蛋白P-P38、P-NF-kB表达以及ELISA检测粘附因子sICAM-1和s-VCAM-1的表达水平，结果显示加入aspirin（2.5mM）后细胞中蛋白P-P38、P-NF-kB表达以及粘附因子sICAM-1和s-VCAM-1的表达水平明显下降（P＜0.05）。该结果说明阿司匹林可抑制ox-LDL、AngⅡ、HG引起的内皮细胞损伤。　　6、阿司匹林对内皮细胞的保护作用依赖于Beclin-1　　成功干扰Beclin-1表达后，阿司匹林促进蛋白p-eNOS、eNOS表达增加及促进NO释放的作用减弱；干扰Beclin-1表达后阿司匹林抑制p-NF-κB和p-P38MAPK表达以及抑制粘附因子sVCAM-1和sICAM-1表达的作用减弱（P＜0.05）。说明阿司匹林对内皮细胞的保护作用依赖于Beclin-1的激活。　　结论：　　阿司匹林可通过诱导细胞自噬对血管内皮功能起保护效应，其机制可能与自噬调节基因Beclin-1有关。

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