组蛋白乙酰化转移酶TIP60动力学和可塑性的分子机制解析

摘要

蛋白质的 SUMO 化修饰一种快速、可逆和简单易行的改变蛋白功能的机制。通过一系列酶促调控的生物化学级联反应，SUMO 共价结合到底物特定的赖氨酸残基上以调控蛋白质的功能。底物的 SUMO 化修饰涉及到多种细胞生物学功能，包括转录调控、信号传导、DNA 损伤修复、维持基因组完整性和染色质重建等。 细胞生物学的一个基本问题是细胞如何在各种胁迫条件下维持基因组的稳定性。尽管许多研究表明组蛋白乙酰化转移酶 TIP60 通过对组蛋白的乙酰化和染色质重建调控了 DNA 损伤修复，然而对 UV 照射胁迫下 TIP60 依赖的DNA 损伤应答的机制却知之甚少。为了全面地分析 UV 照射下调控 TIP60 功能的相互作用蛋白，我们利用基于质谱鉴定的比较蛋白质组学技术系统分析了UV 照射下和“活性” TP60 选择性结合的蛋白，结果表明在UV照射诱导的TIP60复合物中存在一个尚未被揭示的 SUMO 化修饰的蛋白质调控网络，暗示了 TIP60 在 UV 照射下被 SUMO 化修饰的可能。计算生物学预测和生化分析表明 TIP60 的羧基端存在两个高度保守的 SUMO-1 共价结合位点K430和K451。SUMO 化修饰的 TIP60 在 UV 照射下被重新定位到 PML NBs 上，而丧失 SUMO 化修饰能力的 TIP60 突变体则不能定位到 PML NBs 上。SUMO化的 TIP60 招募 p53 定位到 PML NBs 上并顺式激活了 p53 依赖的基因表达，因此 p21 的表达以 TIP60 SUMO 化依赖的方式在 UV 照射下被激活，并由此导致细胞 G1/S 的阻断。抑制 TIP60 的 SUMO 化破坏了 p53 依赖的DNA 损伤反应，而 SUMO 化的 TIP60 在体内和体外都表现为 HAT 活性的上升，并且这种 TIP60 SUMO 依赖的 HAT 活性的上调是激活 UV 照射胁迫下ATR/Chk1/p53 的信号通路的必要条件，因此本研究为 TIP60 如何参与 UV 照射诱导的 DNA 损伤信号传递和 DNA 损伤修复提供了一种可能的机制。 底物的 Ub 化和 SUMO 化是一对化学反应机理相似而功能不同的翻译后修饰方式。研究表明 TIP60 是一个 Ub 化依赖的选择性降解底物，UV 照射抑制了 TIP60 的 Ub 化降解，然而 UV 照射胁迫下 TIP60 表达稳定的机理没有得到充分的阐明。本论文报道了 TIP60 的 SUMO 化修饰随 UV 照射下降解抑制程度的提高而上升，UV 照射诱导的 SUMO 修饰促进了 TIP60 在核仁中大量的聚集，并且这种聚集在添加 Ub 化抑制剂 MG132 的条件下变得更为明显，暗示了 SUMO 化修饰通过抑制 TIP60 的降解稳定了 TIP60 的表达，并且核仁作为 TIP60 Ub 化降解和 DNA 损伤应答的场所调节了 TIP60 的功能。 TIP60 HAT 活性在 UV 诱导的 DNA 损伤下被上调，导致组蛋白 H2A 的乙酰化水平上升，并促进了 ATM 在 Ser1981 的磷酸化，活化的 ATM PS1981 随后激活了 p53 Ser15 和 Ser20 的磷酸化，从而表明 TIP60 SUMO 化修饰是DNA 损伤胁迫下 ATM 活化的广谱性机制。 PML3 是 PML NBs 的主要结构性蛋白，它对于维持 PML NBs 的完整性和调节 PML NBs 的功能方面是必须的。综合生化分析和细胞学技术，我们发现PML3 在调控 TIP60 的功能方面的重要作用。PML3 特异性的招募了 TIP60 重新定位到 PML NBs 上，并且这种招募依赖于 PML3 的 SUMO 化修饰。PML3在体内和 TIP60 氨基端 1～364Aa 区域发生相互作用，该区域也负责了 TIP60 的PML NBs 的定位。免疫共沉降的分析表明，PML3 羧基端 480～633Aa 区域特异性的和 TIP60 相互作用。此外，我们发现 PML3 通过抑制 Mdm2 介导的TIP60 Ub 化降解而保护了 TIP60 的稳定性，其分子机制为 PML3 在体内通过和 Mdm2 竞争性结合 TIP60 而削弱了 Mdm2 和 TIP60 的相互作用。最后，我们证明 PML3 对 p53 和 TIP60 稳定性的调节是相互关联的，表现为 TIP60作为一个中介分子调节了 PML3 对 p53 稳定性的保护，从而暗示体内可能存在PML3-Mdm2-TIP60-p53 的蛋白质相互作用网络，并在肿瘤发生和转录调节等方面发挥着重要的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章文献综述

第一节蛋白质的SUMO化修饰及其功能

一、SUMO与Ub的相似性及SUMO蛋白家族

二、蛋白质SUMO化修饰的级联反应

三、蛋白质SUMO化修饰的调控

四、蛋白质SUMO化修饰的生物学功能

五、SUMO化修饰与PML核体(PML nuclear bodies,PML NBBs)

第二节组蛋白乙酰化转移酶TIP60

一、TIP60结构和TIP60稳定复合物

二、TIP60的乙酰酶催化底物及其催化活性调节

三、TIP60的功能

四、TIP60的功能调节

参考文献

第二章材料和方法

第一节实验材料

一、本论文所用载体及质粒来源

二、本论文所用抗体来源

三、本论文所用细胞株来源

四、本论文所用试剂来源

五、本论文所用siRNA的序列及来源

第二部分实验技术

一、分子克隆技术

二、生化分析技术

三、细胞学技术

四、细胞影像技术

第三章结果与分析

第一部分TIP60的SUMO化修饰通过招募p53到PML NBs激活了UV照射胁迫下的DNA损伤反应

第一节研究背景

第二节实验设计和结果分析

第三节讨论与研究展望

参考文献

第二部分UV照射诱导的TIP60 SUMO化修饰通过稳定核仁中的TIP60激活了ATM/p53通路

第一节研究背景

第二节实验设计和结果分析

第三节讨论与研究展望

参考文献

第三部分PML3稳定了TIP60的PML NBs定位及其相互作用通过阻止TIP60-Mdm2的形成调节了TIP60的稳定性

第一节研究背景

第二节实验设计和结果分析

第三节讨论与研究展望

参考文献

附录

致谢