慢病毒介导的RNAi沉默GTPBP4基因对人结肠癌细胞HT29生物学行为影响的探究

摘要

目的：　　利用pGC SIL-GFP/GTPBP4-RNAi慢病毒载体转染人结肠癌细胞HT29，沉默GTPBP4基因，探究GTPBP4RNAi对HT29细胞生物学行为的影响。　　方法：　　1.慢病毒最佳感染复数(multiplicity of infection，MOI)的筛选及细胞转染　　慢病毒GTPBP4RNAi载体及阴性对照慢病毒载体由上海吉凯基因公司包装完成;预实验用慢病毒转染人HT29细胞筛选出最佳感染复数（multiplicity of infection，MOI），用筛选出的最佳MOI进行正式转染实验。将处于对数生长期的HT29细胞分为实验组和阴性对照组，于转染前一天铺板，转染细胞72h后荧光显微镜下观察GFP标记所激发出的荧光丰度，以此初步判断细胞转染效率。　　2.Real-time PCR及Western blot技术检测转染慢病毒后GTPBP4基因mRNA和蛋白水平的沉默效率　　(1)慢病毒转染细胞72h后，分别提取实验组和对照组HT29细胞总RNA，根据Takara公司逆转录试剂盒说明书合成cDNA，采用Real-time PCR检测GTPBP4基因mRNA表达水平;　　(2)慢病毒转染细胞72h后，分别提取实验组及阴性对照组总蛋白，采用Western blot检测GTPBP4蛋白表达水平。经蛋白变性、上样、电泳、电转、化学发光，得到蛋白条带并分析基因的沉默效率;　　3.慢病毒沉默GTPBP4基因对HT29细胞生物学行为的影响　　(1)CCK-8法检测沉默GTPBP4基因后，HT29细胞在体外增殖能力的改变：分别于细胞转染后分板的24h、48h、72h、96h四个时间点，检测实验组和阴性对照组两组细胞在体外的增殖能力。　　(2)平板克隆形成实验检测慢病毒转染细胞沉默GTPBP4基因后单个细胞体外成瘤能力的变化。　　(3)划痕实验检测GTPBP4基因沉默后，对结肠癌细胞HT29体外迁移能力产生的影响。　　(4)Transwell实验检测GTPBP4基因沉默对结肠癌细胞HT29体外侵袭能力的影响。　　(5)PI-FACS法检测沉默GTPBP4基因对结肠癌细胞HT29增殖周期分布的影响。　　(6)AnnexinV-APC单染法检测GTPBP4基因沉默后，两组细胞凋亡率的差别。　　4.慢病毒沉默GTPBP4基因对p53和Survivin蛋白表达量及定位的影响　　利用Western blot和免疫荧光技术，检测慢病毒转染人结肠癌细胞HT29沉默GTPBP4基因对p53和Survivin蛋白表达量及定位的影响。　　结果：　　1.MOI的筛选　　GTPBP4RNAi转染人结肠癌细胞HT29的MOI值为10.　　2.慢病毒转染HT29细胞后，GTPBP4基因mRNA水平和蛋白表达水平显著降低。　　(1)采用2-△△Ct法统计实验组和阴性对照组中GTPBP4基因mRNA表达水平。　　结果：显示：实验组GTPBP4mRNA相对表达量为0.026±0.01，阴性对照组GTPBP4mRNA相对表达量为0.993±0.06，且两组间差异具统计学意义(P＜0.05)，故GTPBP4RNAi能够有效地抑制mRNA的表达。　　(2)Western blot结果：在内参蛋白条带灰度基本一致的条件下，实验组GTPBP4蛋白条带灰度明显低于阴性对照组。　　3.慢病毒沉默GTPBP4基因对HT29细胞生物学行为的影响　　(1)CCK-8结果：在转染后分板的24h、48h、72h、96h，实验组测得的OD值均值分别为0.77±0.01、1.06±0.02、1.64±0.02、2.01±0.06，阴性对照组OD值均值分别为0.92±0.03、1.34±0.04、2.27±0.02、3.17±0.09，实验组OD值小于对照组，且两组间差异具统计学意义(P＜0.05)。实验组较阴性对照组细胞增殖指数显著降低。　　(2)平板克隆形成实验：种板2周后，实验组生成细胞集落个数均数为67.00±3.61，对照组生成细胞集落个数均数为115.70±10.02，实验组细胞集落个数明显少于阴性对照组，且两组间差异具统计学意义(P＜0.05)。　　(3)划痕实验：在划痕48h后，实验组融合平均距离为500.01±1.82PX（像素），阴性对照组融合平均距离为781.23±10.51PX（像素），实验融合距离明显小于阴性对照组。　　(4)Transwell实验：细胞接种的48h，固定染色后，实验组穿过Matrigel胶的细胞数目均数为91.40±4.39，阴性对照组穿过Matrigel胶细胞数目均数为263.80±11.90，实验组细胞数目明显小于阴性对照组，且两组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　(5)细胞周期结果：与阴性对照组相比，实验组处于G1的细胞数目比例显著增加，而处于S期细胞数目明显减少。　　(6)细胞凋亡结果：实验组的细胞凋亡比例明显高于阴性对照组。　　4.慢病毒沉默GTPBP4基因对p53和Survivin蛋白表达量及定位的影响　　在目的基因GTPBP4沉默的条件下，p53蛋白表达明显上调，而Survivin蛋白表达明显下调;荧光显微镜下观察发现，实验组与阴性对照组的p53，Survivin蛋白均在核表达，并没有发生表达位置的改变。　　结论：　　1.pGCSIL-GFP/GTPBP4-RNAi慢病毒载体能够感染人结肠癌HT29细胞，并且有效沉默GTPBP4基因。　　2.HT29细胞GTPBP4基因沉默后，细胞增殖活性受到抑制、克隆形成能力、体外迁移侵袭能力降低，细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。　　3.GTPBP4在结直肠癌发生发展中可能作为癌基因发挥作用。　　4.GTPBP4基因可能通过调节p53、Survivin蛋白表达在结直肠癌发生发展过程中扮演重要角色。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与方法

结果

1．HT29细胞的最佳转染复数(MOI)

2．Real-Time PCR和Western blot检测GTPBP4 RNAi分别在mRNA水平和蛋白水平沉默效果

3．慢病毒沉默GTPBP4基因对HT29细胞生物学行为的影响

4．慢病毒沉默GTPBP4基因对p53和Survivin蛋白表达量及定位的影响

讨论

结论

参考文献

英文缩略词对照表

致谢

结直肠癌发生发展过程中相关基因研究进展 综述

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