姜黄素抑制实验性脉络膜亲生血管的机制研究

摘要

本文从以下四部分进行阐述　　第一章　　目的：　　采用532nm倍频激光建立实验性脉络膜新生血管(ChoroidalNeovascularization，CNV)动物模型，为CNV的相关基础研究提供模型参考。　　方法：　　1.应用532nm倍频激光光凝棕色挪威(Brown Norway, BN)大鼠建立实验性CNV模型，分别在光凝后1d、3d、Sd、7d、14d、21d采用眼底照、眼底荧光血管造影(Fundus Fluorescein Angiograph，FFA)和吲哚菁绿血管造影(Indocyanine green Angiography，ICGA)观察光凝后不同时间点CNV的变化情况。　　2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用HE染色法观察光凝后不同时间点CNV中央厚度。　　3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用免疫组织化学染色法观察光凝后不同时间点CNV眼组织中CD105因子表达的情况。　　结果：　　1.光凝后1d光斑处无荧光素渗漏;光凝后3d、5d仅有少量光斑处有荧光素渗漏。光凝后7dCNV生成率为70.18％，荧光素渗漏平均光密度值为128.30士11.21。光凝后14dCNV生成率为78.18％，平均光密度值为182.12士6.59，与光凝后7d组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。光凝后21d，CNV生成率和荧光素渗漏平均光密度值与光凝后14d组比较差异无统计学意义。　　2.HE染色结果显示:随着光凝后时间的增加，CNV中央厚度逐渐增加，光凝后7dCNV厚度为48.92士2.81μm，较光凝后1d显著增加（P＜0.05）;光凝后14dCNV厚度为61.98士5.06μm，较光凝后7d显著增加(P＜0.05);光凝后21dCNV厚度为61.78士4.03μm，与14d组比较差异无统计学意义。　　3.CD105免疫组化结果显示:　　结论：　　1.应用532nm激光光凝可以成功建立BN大鼠实验性CNV动物模型。　　2.CNV在光凝后7d至14d生长迅速，至21d逐渐稳定，此模型具有成模速度快，成模率高、重复性好、成本低的优点，可作为CNV基础研究的动物模型。　　3.眼底照、FFA、ICGA、HE染色和免疫组化检查可以动态观察CN-V的变化。　　第二章　　目的：　　观察中药单体姜黄素对BN大鼠实验性CNV的抑制作用，以及对AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路活性的影响，为姜黄素治疗CNV提供实验依据。　　方法：　　1.应用532nm倍频激光光凝诱导BN大鼠建立CNV模型，造模后的大鼠被随机分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组，在光凝后14d进行眼底照、FFA与ICGA检查。　　2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用HE染色法观察不同组CNV中央厚度。　　3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本，采用免疫组织化学法观察不同组CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的表达情况。　　4.采用RT-qPCR法检测CNV眼组织中AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子mRNA的相对表达量。　　5.采用蛋白免疫印迹(Westernblot)法检测CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的相对表达量。　　结果：　　1.正常组未打激光，模型组，雷珠单抗组，姜黄素低、中、高剂量组CNV生成率分别为78.18％、73.21％、77.19％、75.86％、74.55％，组间比较差异无统计学意义;荧光素渗漏平均光密度值分别为182.12士6.59、119.22士8.03、166.45士8.33、164.34士5.69、149.22士6.45;雷珠单抗组较模型组显著降低(P＜0.05);姜黄素低、中、高剂量组较雷珠单抗组显著升高（P＜0.05），其中姜黄素高剂量组较模型组显著降低（P＜0.05）。　　2.HE染色结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织各层结构清晰、排列整齐。　　3.免疫组化结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织结构中AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子表达呈阴性，未见棕黄色反应物。　　4.mRNA结果显示:　　5.Westernblot结果显示:光凝后14d，AKT蛋白各组间比较差异无统计学意义。　　结论：　　1.高剂量姜黄素(400mg/Kg/d)对激光诱导的BN大鼠实验性CNV的形成具有抑制作用。　　2.姜黄素抑制BN大鼠实验性CNV的机制可能与抑制AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路的激活，降低相关因子的表达有关。　　第三章　　目的：　　观察姜黄素对氯化钴(CoCl2)诱导的人视网膜色素上皮细胞株-19(adultretinal pigment epithelial cell line-19，ARPE-19)细胞缺氧模型中AKT、HIF-1α和VEGF因子mRNA及蛋白表达的影响。　　方法：　　1.采用CoCl2诱导ARPE-19细胞建立化学性缺氧模型，应用CCK-8法筛选造模试剂CoCl2、实验药物姜黄素和阳性对照药雷珠单抗的浓度，同时检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞活性的影响。　　2.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组，应用RT-qPCR法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、HIF-1α和VEGF mRNA表达量的影响。　　3.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组，应用Westernblot法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达量的影响。　　结果：　　1.CCK-8细胞活性检测:随着CoCl2浓度的增加，ARPE-19细胞活性呈现先增长后抑制，当CoCl2终浓度≧200μM时，细胞活性显著降低(P＜0.05)。　　2.RT-qPCR结果显示:模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组(P＜0.05);雷珠单抗组均低于模型组(P＜0.05);姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P＜0.05);姜黄素高剂量组较模型组显著降低(P＜0.05);与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。　　3.Westernblot结果显示:AKT蛋白相对表达量各组间比较差异无统计学意义。　　结论：　　1.应用CoCl2可成功建立APRE-19细胞化学缺氧模型。　　2.CoCl2在终浓度为100μM时可增加细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达量。　　3.高剂量姜黄素(100μM)可降低CoCl2诱导的ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达。　　4.姜黄素(100μM)对CoCl2诱导ARPE-19细胞缺氧具有保护作用。　　第四章　　目的：　　观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalvein endothelial cells，HUVEC)细胞增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响。　　方法：　　1.将ARPE-19细胞条件培养液分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组，分别作用于HUVEC细胞;采用CCK-8法观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响。　　2.采用细胞划痕实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的水平迁移的影响。　　3.采用Transwell小室迁移实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的垂直迁移的影响。　　4.采用Transwell小室侵袭实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的侵袭的影响。　　5.采用Matrigel基质胶管腔形成实验，观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞管腔形成的影响。　　结果：　　1.ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响，组间差异无统计学意义。　　2.HUVEC细胞水平迁移实验结果显示:　　3.HUVEC细胞垂直迁移实验结果显示:　　4.HUVEC细胞侵袭实验结果显示:　　5.HUVEC细胞管腔形成实验结果显示:　　结论：　　1.ARPE-19细胞姜黄素低（6.25μM）、中(25μM)、高剂量组(100μM)条件培养液可显著抑制HUVEC细胞水平迁移;其中高剂量组条件培养液可显著抑制HUVEC细胞垂直迁移。　　2.ARPE-19细胞姜黄素高剂量组(100μM)条件培养液可抑制HUVEC细胞侵袭。　　3.ARPE-19细胞姜黄素中（25μM）、高剂量组(100μM)条件培养液可抑制HUVEC细胞管腔形成。　　4.姜黄素可在细胞水平抑制血管的生成。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

引言

第一章532nm倍频激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管模型的建立

1．实验动物、仪器、耗材与试剂

1．1实验动物

1．2实验仪器及耗材

1．3实验试剂

2．实验方法

2．1实验分组

2．2 532nm倍频激光建立CNv模型

2．3眼底照相、FFA及ICGA观察CNV变化

2．4制备病理学标本

2．5 HE染色

2．6免疫组织化学检测

3．图像分析与统计学方法

3．1眼底照、FFA及ICGA图像

3．2 HE染色图像

3．3免疫组化图像

3．4统计学方法

4．结果

4．1眼底照、FFA与ICGA结果

4．2 HE染色结果

4．3 CDl05免疫组化结果

5．讨论

5．1 CNv模型建立的方法

5．2 532nm倍频激光诱导BN大鼠建立实验性CNV模型的机制

5．3 532nm倍频激光诱导BN大鼠CNV模型的评价

6．结论

第二章姜黄素通过AKT／p-AKT／HIF-1α／VEGF信号通路抑制BN大鼠CNV的实验研究

1．实验动物、仪器、耗材与试剂

1．1实验动物

1．2实验仪器与耗材

1．3实验试剂

2．实验方法

2．1实验药物配制

2．2实验分组及给药

2．2 532nm倍频激光建立实验性CNv模型

2．3眼底照相、FFA及ICGA观察CNV变化

2．4病理学标本制备

2．5 HE染色

2．6免疫组织化学检测

2．7 RT-qPCR检测mRNA表达

2．8 westernblot检测蛋白表达

3．图像分析与统计学方法

3．1眼底照、FFA与ICGA图像

3．2 HE染色图像

3．3免疫组化图像

3．4 RT-qPCR结果分析

3．5 Westernblot结果分析

3．6统计学方法

4．实验结果

4．1眼底照、FFA与ICGA结果

4．2 HE染色结果

4．3免疫组化结果

4．4 RT-qPCR结果

4．5 westernblot结果

5．讨论

5．1新生血管与中药单体

5．2姜黄与姜黄素

5．3姜黄素与眼部新生血管

5．2 CNV的中医认识

5．5姜黄素抑制CNV的机制

6．结论

第三章姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型中AKT、HIF-1α和VEGF因子的影响

1．实验细胞、试剂、药物及仪器

1．1实验细胞

1．2实验试剂

1．3实验药物及溶液的配制

1．4实验仪器

2．实验方法

2．2造模试剂CoCl2、实验药物姜黄素及阳性对照药雷珠单抗浓度的筛选

2．3实验分组与干预

2．5 RT-qPCR检测

2．6westernblot检测

3．结果分析与统计学方法

3．1 CCK-8检测细胞活性结果分析

3．2 RT-qPCR结果分析

3．3 Westernblot结果分析

3．4统计学方法

4．实验结果

4．2 CoCl2对ARPE-19细胞活性的影响

4．3姜黄素对ARPE-19细胞活性的影响

4．4雷珠单抗对CoCl2诱导的ARPE-19细胞活性的影响

4．5 RT-qPCR结果

4．6 westernblot结果

5．讨论

5．1细胞缺氧模型的建立

5．2 CoCl2诱导ARPE-19细胞缺氧模型的机制

5．3姜黄素对CoCl2诱导ARPE-19细胞缺氧的保护作用

第四章非接触共培养体系观察ARPE-19细胞姜黄素的条件培养液对HUVEC细胞形态学的影响

1．实验细胞、药物、试剂及仪器

1．1实验细胞

1．2实验试剂

1．3实验试剂的配制

1．4实验仪器

2．实验方法

2．1 HUVEC细胞株复苏培养、传代与冻存

2．2．1缺氧条件下ARPE-19细胞不同组条件培养液的制备

2．3划痕实验检测细胞水平迁移

2．4 Transweu小室法检测细胞垂直迁移

2．5 Transwell小室法检测细胞侵袭

2．6 Matrigel基质胶法检测细胞管腔形成

3．统计学方法

4．实验结果

4．1正常HUVEC细胞形态

4．2 CCK-8结果

4．3划痕实验细胞水平迁移结果

4．4 Transwell小室实验细胞垂直迁移结果

4．5 Transwell小室实验细胞侵袭结果

4．6 Matrigel基质胶实验细胞管腔形成结果

5．讨论

5．1细胞迁移

5．2细胞侵袭

5．3细胞管腔形成

6．结论

参考文献

创新性

不足与展望

综述

研究生期间学术表现

致谢

附录