尾叶桉×细叶桉RNA自动提取及利用RNA--seq挖掘材性候选基因

摘要

桉树作为世界三大人工林树种之一，生长速度快、材性好且基因组较小，是林木遗传育种改良的理想材料，材性改良是桉树育种的主要研究内容之一。随着林木功能基因组学的不断发展，发展一种高通量的RNA自动提取的方法在桉树功能基因组学研究也具有重要的意义。因此，本论文首先针对RNA提取这一重要环节，以桉树叶片为材料，优化建立一种树木叶片RNA的自动提取方法。基于建立的RNA提取方法，利用RNA-seq技术，针对尾叶桉×细叶桉F1子代的实生苗和无性系的极端表型个体开展转录组测序，材性性状包括木材基本密度、半纤维素含量、纤维素含量、木质素含量，深入研究材性性状合成相关的基因及转录因子的差异基因表达情况，挖掘木材材性性状的关键候选基因与调控转录因子，以期有效解析桉树木材材性形成的遗传背景、基因网络变化及表达模式，为桉树木材形成和发育的研究提供候选基因，加快桉树分子辅助育种的进程。通过研究，主要得到以下结论:　　(1)基于Kingfisher Flex全自动磁珠提取纯化系统，以细叶桉叶片为材料，利用5种磁珠法RNA提取试剂盒(A/B/C/D/E)比较提取RNA的质量和纯度，筛选出试剂盒C为最佳试剂盒。在试剂盒C默认提取程序基础上，利用正交设计L9(34)，研究Kingfisher F1ex全自动磁珠提取纯化系统上不同洗涤速度、洗脱速度及时间等机器参数对提取RNA的浓度和纯度的影响。正交试验结果表明，对提取RNA的浓度和纯度影响最大的机器参数是洗涤速度，正交试验最优程序组合下提取RNA的纯度稍优于试剂盒C，但是得率仅为试剂盒C的1/3，综合比较后确认试剂盒C默认程序为提取细叶桉叶片RNA的最优提取程序。　　(2)基于RNA-seq测序数据进行基因差异表达分析，获得了实生苗/无性系材料在木材基本密度、半纤维素、纤维素和木质素含量这4组材性性状分组中的差异表达基因(DEGs)数分别为396/831个、139/3543个、172/1814个、800/831个;上调DEGs数分别为262/361个、43/91O个、82/524个、513/1306个;下调DEGs数分别为134/470个、96/2633个、90/392个、287/508个。对以上获得的这些DEGs按照分组分别进行GO和KEGG富集分析，实生苗/无性系的DEGs在木材基本密度、半纤维素、纤维素、木质素这4组材性性状分组中的富集到的GO Terms数分别为86/78条、46/105条、65/123条、179/326条，显著富集的GO Terms数分别为18/1条、1/27条、0/26条、0/46条;富集到的Pathway数分别为42/78条、20/115条、52/85条、83/115条，显著富集的Pathway代谢通路数分别为0/O条、O/9条、O/1条、O/11条。　　(3)共获得与木材基本密度性状、半纤维素性状、纤维素性状、木质素性状相关的候选基因依次为43个、32个、25个、37个，与各性状合成相关的关键酶基因均在候选基因中被发现，并包含与拟南芥次生壁合成相关基因的同源基因如纤维素合成酶基因Eucgr.H00185(CSLG3)、肉桂醇脱氢酶基因Eucgr.D01622(CAD9)、甲基转移酶基因Eucgr.LO1392(CCOMT9)等。　　(4)根据实生苗和无性系在4组材性性状中DEGs的转录因子富集分析结果，共获得33个可能与次生壁合成调控相关的上游调控转录因子。将这33个调控转录因子与DEGs取交集，共获得8个具有差异表达的调控转录因子，这8个转录因子主要涉及调控韧皮部或木质部组织发生、木质部维管组分细胞的分化等的生物学过程。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1．1研究背景

1．1．2研究的目的和意义

1．1．3项目来源和经费支持

1．2国内外研究现状及发展趋势

1．2．1 RNA提取方法研究进展

1．2．2木材形成的分子调控机制及国内外研究进展

1．3主要研究内容

1．3．1研究目标

1．3．2研究内容

1．3．3拟解决的重点问题

1．4研究技术路线

第二章基于Kingfisher Flex系统桉树叶片RNA的提取方法比较及优化

2．1材料与方法

2．1．1植物材料

2．1．2磁珠试剂盒

2．1．3试验方法

2．2结果与分析

2．2．1 RNA样品完整性、浓度和纯度分析

2．2．2最佳磁珠法RNA提取试剂盒的筛选

2．2．3正交试验优化

2．2．4最佳试剂盒C对细叶桉及其他树种的RNA提取

2．2．5 cDNA文库构建及质检

2．3小结

第三章基于RNA-seq挖掘尾叶桉×细叶桉材性候选基因

3．1材料与方法

3．1．1材料

3．1．2 RNA提取及质量检测

3．1．3 cDNA建库和测序

3．1．4测序数据质控过滤与评估

3．1．5参考基因组比对及转录组组装和定量

3．1．6差异基因表达分析

3．1．7韦恩图比较分析

3．1．8差异表达基因的GO注释及功能富集分析

3．1．9差异表达基因KEGG Pathway富集分析

3．1．10差异表达基因转录因子富集分析

3．2结果与分析

3．2．1 RNA提取与质量检测

3．2．2测序数据质量评估

3．2．3实生苗和无性系样品的差异表达基因分析

3．2．4实生苗和无性系样品差异表达基因的GO功能富集分析

3．2．5实生苗和无性系样品的差异表达基因的KEGG Pathway富集分析

3．2．6实生苗和无性系差异表达基因的转录因子分布

3．2．7实生苗和无性系材性性状相关候选基因分析

3．2．8实生苗和无性系的次生壁合成相关的转录因子分析

3．3小结

第四章结论与讨论

4．1结论

4．1．1基于Kingfisher Flex系统树木叶片RNA的提取方法比较及优化

4．1．2基于RNA-seq尾细桉材性候选基因及转录因子的挖掘

4．2讨论

4．2．1树木叶片RNA的自动提取方法及在林木分子生物研究中的应用

4．2．2与4组木材材性性状相关的关键候选基因及转录因子

4．2．3实生苗和无性系共有DEGs

4．3展望

参考文献

附录

在读期间学术研究

致谢