新型电镜技术研究酵母细胞及小鼠胰岛细胞和组织的超微结构

摘要

目前生命科学的研究进入到了系统生物学阶段，对于整体生命现象的研究，需要解决很多关键科学问题。1、如何保持样品接近生理状态？2、如何在细胞乃至组织层面上对样品进行大尺度的三维重构，得到细胞器、细胞和组织等的空间分布？　　电镜常应用广泛的常规化学固定方法，但化学固定剂与生物样品的交联具有选择性，容易造成假象。而近年来出现的高压快速冷冻(High Pressure Freezing，HPF)和冷冻替代技术(Freezing Substitution，FS)可以使生物样品快速冷冻固定，有效减少了样品制备过程中化学试剂对细胞结构的破坏，能够观察到细胞器近似自然状态下的超微结构。本文发展和完善了新的高压冷冻技术和冷冻替代技术样品制备方法用于电镜超微结构的观察，并分别在酵母细胞、哺乳动物细胞和胰岛组织的电镜样品制备中，获得了细胞器在接近生理状态的超微结构。同时发展了聚焦离子束扫描电镜(FocusedIon Beam scanning electron microscopy，FIB/SEM)三维重构技术，研究了Ⅱ型糖尿病模型ob/ob小鼠胰岛β细胞致密核心囊泡的变化，为糖尿病的发生提供了依据。　　单细胞生物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为一种广泛应用在研究真核细胞生命过程的重要模式生物，其超微结构对其功能的研究起着重要作用。目前酵母细胞的电镜样品制备大多使用传统的高锰酸钾等化学固定方法，效果不理想。本文首先针对培养的酿酒酵母细胞摸索和发展了新的高压冷冻和冷冻替代技术方法，成功制备了电镜超薄切片的样品，并与传统的化学固定方法制备的样品进行了比较，在透射电子显微镜下得到了酵母细胞更加清晰的细胞壁、细胞核、液泡、线粒体和内质网以及液泡内颗粒和细胞核内的染色质等精细结构。随后我们又将发展的高压冷冻和冷冻替代技术样品制备新方法应用在内分泌疾病糖尿病研究的主要细胞类型—哺乳动物大鼠骨髓瘤细胞(INS-1)和小鼠胰岛组织，同样取得到了理想效果，也为此种新技术研究哺乳动物细胞超微结构提供了参考。　　同时，本文将FIB/SEM三维重构技术应用于具有重要临床意义的胰岛组织细胞，获得了小鼠胰岛β细胞大尺度的三维结构。胰岛素是生物体内分泌调控血糖水平的重要物质，被包装和储存于胰岛β细胞中的致密核心囊泡。通过FIB/SEM三维重构和自动化程序识别，我们定量分析了胰岛β细胞致密核心囊泡在ob/ob小鼠中的形态数量变化。结果表明，肥胖症模型ob/ob小鼠胰岛素囊泡表现出数量变多，尺寸变小、密度变大、致密核心的灰度变深等表征，证明在ob/ob小鼠模型中囊泡合成与运输过程存在严重缺陷。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1．1研究背景

1．1．1电子显微镜概述

1．1．2电镜样品制备技术

1．1．3电镜三维重构

1．1．4模式生物-酵母

1．1．5糖尿病与胰岛素

1．2研究现状

1．2．2胰岛素瘤细胞及胰岛致密核心囊泡的超微结构研究现状

1．3研究意义及内容

1．3．1研究意义

1．3．2研究内容

第二章新型高压冷冻和冷冻替代技术制备酵母细胞电镜样品和超微结构观察

2．1前言

2．2材料与方法

2．2．1实验材料

2．2．2实验方法

2．3实验结果

2．4实验讨论

第三章高压冷冻和冷冻替代技术研究大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)的超微结构

3．1前言

3．2材料与方法

3．2．1实验材料

3．2．2实验方法

3．3实验结果

3．3．2 INS-1细胞超微结构观察

3．4实验讨论

第四章双束扫描电镜技术研究小鼠胰岛超微结构

4．1前言

4．2材料与方法

4．2．1实验材料

4．2．2实验方法

4．3实验结果

4．3．2 β细胞的FIB／SEM重构

4．3．3 FIB／SEM三维重构对ob／ob小鼠胰岛素囊泡分布的研究

4．4实验讨论

5．1总结

5．2展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果