南方型紫花苜蓿耐盐突变体盐胁迫响应差异基因鉴定与分析

摘要

中国海域辽阔，滨海盐碱地只有小部分被利用耕种，大部分还为荒地和海涂地，海岸带拥有大量的盐碱土待开发利用，是重要的后备土地资源。滨海盐碱地改良和生态绿化是中国沿海城市化进程中一项异常艰巨的重要难题。根据近年来国内外实践经验，筛选耐盐植物是进行滨海盐碱地生物改良和生态绿化最具光明前景的经济有效的方法。紫花苜蓿(Medicago sativaL.)是一种具有较强耐盐性的豆科植物，栽培历史悠久，在全球广泛种植，具有一定的观赏价值，是进行盐碱地改良和园林绿化的理想植物。本研究以高秋休眠级南方型紫花苜蓿‘Millennium’的耐盐突变体为材料，进行转录组测序分析，筛选盐胁迫响应差异基因，并对其进行GO功能显著性分析、KEGGPathway显著性富集分析和转录因子分子，已期探究耐盐相关基因参与的主要生物学功能和代谢途径，为进一步研究紫花苜蓿耐盐分子机制，培育耐盐新品种奠定基础。本研究结果如下:　　1、通过对南方型紫花苜蓿耐盐突变体幼苗进行250mmol/L NaC1处理0、24、48、72和96h时生理指标的测定，发现在盐胁迫72h内，叶片相对含水量持续降低，脯氨酸含量、相对电导率、MDA含量和SOD活性持续升高;在盐胁迫大于72h后，叶绿素含量和SOD活性明显下降，脯氨酸含量、相对电导率和MDA含量升高幅度增大。表明250mmol/L NaCl处理72h是紫花苜蓿耐盐突变体幼苗盐胁迫响应的最佳时间，为接下来耐盐分子机制研究提供了依据。　　2、利用RNA-Seq技术，经过250mmol/L NaCl胁迫72h，南方型紫花苜蓿耐盐突变体幼苗叶片样品中共检测到30900个基因表达量发生改变，其中7694个基因被定义为差异基因（4187个基因上调表达，3507个基因下调表达），包括隶属于50个转录家族的422个转录因子（268个转录因子上调表达，154个转录因子下调表达）。　　3、实时荧光定量PCR验证表明，随机选择的8个差异表达基因在盐胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致，表明了转录组测序数据的可靠性。　　4、GO功能显著性分析显示，差异表达基因的生物学功能主要表现在催化活性、结合、细胞组分、细胞、代谢过程和细胞过程。KEGG Pathway显著性富集分析显示，差异表达基因广泛涉及代谢途径和次生代谢产物生物合成。候选出MsGST、MsL-APX、MsGPX、MsRLK、MsSIK、MsSnRK、MsCMLs、MsCMO、MsMIP、MsP5CS1、MsP5CS3、MsABCB、MsWBC、MsLEA3和MsPP2C等重要耐盐相关基因。转录因子分析发现，应答基因数量最多的是MYB基因家族，其次是WRKY、NAC、bHLH、AP2-EREBP和GRAS等基因家族。候选出MsA lfin-like、MsERF110、MsANT、MsbHLH36、MsNAI1、MsbZIP、MsC3H、MsGRAS、MsNAD、MsMYB、MsMYB85、MsNAC、MsRWP-RK、MsTrihelix和MsWRKY等耐盐相关转录因子。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 研究背景和意义

1．1．1 课题来源

1．1．2 研究背景和意义

1．1．3 紫花苜蓿

1．2 植物耐盐分子机制研究进展

1．2．1 离子平衡机制

1．2．2 渗透调节机制

1．2．3 活性氧清除机制

1．2．4 盐胁迫信号转导与调控

1．3 紫花苜蓿耐盐性研究进展

1．3．1 紫花苜蓿耐盐品种选育进展

1．3．2 紫花苜蓿耐盐调控机理研究进展

1．4 转录组学在植物抗逆性方面的研究进展

1．4．2 Illumina转录组测序(RNA-Seq)技术应用

1．5 研究内容和技术路线

1．5．1 研究内容

1．5．2 技术路线

第二章 盐胁迫下紫花苜蓿耐盐突变体的生理响应机制

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 盐胁迫对紫花苜蓿耐盐突变体叶片相对含水量的影响

2．2．2 盐胁迫对紫花苜蓿耐盐突变体叶绿素含量的影响

2．2．3 盐胁迫对紫花苜蓿耐盐突变体脯氨酸含量的变化影响

2．2．4 盐胁迫对紫花苜蓿耐盐突变体细胞膜透性的影响

2．2．5 盐胁迫对紫花苜蓿耐盐突变体MDA含量的变化影响

2．2．6 盐胁迫对紫花苜蓿耐盐突变体SOD活性的影响

2．3 讨论

2．3．1 盐胁迫对紫花苜蓿耐盐突变体幼苗生长状况的影响

2．3．2 盐胁迫对紫花苜蓿耐盐突变体幼苗光合作用的影响

2．3．3 盐胁迫对紫花苜蓿耐盐突变体幼苗糁透调节物质的影响

2．3．4 盐胁迫对紫花苜蓿耐盐突变体幼苗细胞膜系统的影响

2．3．5 盐胁迫对紫花苜蓿耐盐突变体幼苗细胞膜系统的影响

2．4 小结

第三章 紫花苜蓿耐盐突变体叶片RNA样本制备与转录组测序

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 提取RNA的质量检测分析

3．2．2 测序质量分析

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 盐胁迫前后紫花苜蓿耐盐突变体差异基因表达分析

4．1 材料与方法

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 紫花苜蓿耐盐突变体叶片盐胁迫响应DEGs筛选结果分析

4．2．2 差异基因的qRT-PCR验证

4．2．3 DEGs表达模式聚类结果分析

4．2．4 DEGs的GO功能显著性富集分析

4．2．5 DEGs的KEGG Pathway显著性富集分析

4．2．6 紫花苜蓿耐盐突变体叶片盐胁迫响应重要DGEs分析

4．2．7 紫花苜蓿耐盐突变体叶片盐胁迫响应差异转录因子分析

4．3 讨论

4．3．1 活性氧清除相关基因

4．3．2 渗透调节相关基因

4．3．3 信号传导相关基因

4．3．4 蛋白调节相关基因

4．3．5 激素调节相关基因

4．3．6 其他耐盐相关基因

4．3．7 转录因子相关基因

4．4 小结

第5章 结论

参考文献

附录

个人简介

致谢