鹅卵泡闭锁过程中氧化应激诱导颗粒细胞自噬的研究

摘要

浙东白鹅是中国肉鹅中著名的优良品种，具有生长速度快、肉质鲜美等特点，然而其就巢性强，产蛋量低，使品种的发展收到严重阻碍。对就巢期的母鹅的卵巢进行观察，发现其中卵泡均发生不同程度的闭锁，众多研究表明，禽类卵泡中颗粒细胞凋亡是导致其卵泡闭锁的主要原因。哺乳动物中的研究显示，细胞凋亡与细胞自噬密切相关，且作用机制复杂。鉴于此，本试验试图从自噬的角度研究卵泡闭锁的相关机制。　　试验通过透射电镜、免疫组化等方法，对正常生长卵泡和闭锁卵泡中自噬体进行定位与观察，并采用Western blot、荧光定量PCR等技术，对自噬体标记蛋白LC3的表达量进行检测，判断卵泡闭锁是否与细胞自噬相关。同时，通过多个生化指标的测定，检测氧化应激是否通过诱导卵泡细胞的自噬促进卵泡闭锁。此外，在动物试验结果的基础上，通过培养原代鹅卵泡颗粒细胞，建立氧化应激模型，以进一步在细胞水平进行验证。在鹅卵泡颗粒细胞氧化模型的基础上，分别加入Rapamycin和3-methyladenine(3-MA)，以检测卵巢颗粒细胞中mTOR信号通路和Beclin-1信号通路，探究氧化应激诱导鹅卵泡颗粒细胞自噬的作用机制。　　研究结果表明:与生长卵泡相比，闭锁卵泡颗粒细胞中自噬水平升高（P＜0.05），氧化应激水平升高（P＜0.05）。通过H2O2诱导颗粒细胞建立氧化模型，检测发现自噬水平显著升高（P＜0.05）。对氧化应激模型进行3-MA或Rapamycin共处理，发现Rapamycin共处理组LC3-Ⅱ蛋白表达量显著升高（P＜0.05），自噬体数量显著增多(P＜0.05)，而3-MA对颗粒细胞自噬水平无影响。　　研究结论:本研究证明了鹅就巢期卵泡闭锁与颗粒细胞自噬相关，明确了氧化应激引起的内环境变化是诱导颗粒细胞自噬的重要因素。且在氧化条件下，mTOR信号通路是诱导颗粒细胞发生自噬的主要途径。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 我国家鹅养殖现状

1．1．1 家鹅的起源

1．1．2 我国家鹅的养殖现状

1．1．3 禽就巢期卯泡闭锁研究进展

1．1．4 浙东白鹅

1．2 颗粒细胞自噬与卵泡闭锁

1．2．1 自噬体形态

1．2．2 自噬的功能意义

1．2．3 参与自噬的分子及调控机制

1．2．4 卵泡颗粒细胞自噬与卵泡闭锁

1．2．5 细胞自噬的检测方法

1．3 氧化应激

1．3．1 自由基

1．3．2 氧化应激对卵泡的影响

1．3．3 引起动物氧化应激的因素

1．4 本研究的目的、意义及内容

1．4．1 研究目的及意义

1．4．2 研究内容

第二章 就巢期卵泡发生氧化应激和自噬规律的研究

2．1 材料与方法

2．1．1 试剂与仪器

2．1．2 试验动物

2．1．3 浙东白鹅就巢期和产蛋期卵泡组织形态的变化

2．1．4 浙东白鹅就巢期和产蛋期血清PRL和卵泡PRLR的表达检测

2．1．5 正常与闭锁卵泡氧化应激水平测定

2．1．6 自噬体定位与及其结构观察

2．1．7 正常与闭锁卵泡自噬水平检测

2．1．8 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 浙东白鹅产蛋期与就巢期卵泡组织形态的变化

2．2．2 浙东白鹅就巢期和产蛋期血清PRL和卵泡PRLR的表达

2．2．3 浙东白鹅产蛋期与就巢期卵泡中氧化应激水平分析

2．2．4 鹅就巢期卵泡发生自噬的规律分析

2．2．5 浙东白鹅正常卵泡与闭锁卵泡自噬水平检测结果

2．3 讨论

2．3．1 透射电镜对自噬体的观察

2．3．2 LC3-Ⅱ的表达量与白噬水平的关系

2．4 小结

第三章 氧化应激诱导鹅卵泡颗粒细胞自噬的机制研究

3．1 材料与方法

3．1．1 试剂与仪器

3．1．2 试验动物

3．1．3 鹅卵泡颗粒细胞培养与鉴定

3．1．4 鹅卵巢颗粒细胞氧化应激模型建立

3．1．5 颗粒细胞氧化应激模型自噬水平的检测

3．1．6 mTOR、Beclin-1信号通路检测

3．1．7 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 鹅卵泡颗粒细胞培养与鉴定结果

3．2．2 颗粒细胞氧化应激模型建立

3．2．3 颗粒细胞氧化应激模型自噬水平检测结果

3．2．4 mTOR、Beclin-1信号通路检测

3．3 讨论

3．3．1 原代培养的鹅卵泡颗粒细胞模型评价

3．3．2 本研究中COX-2的两种检测结果分析

3．4 小结

第四章 结论

参考文献

作者简介

致谢