太湖鹅胆固醇7α-羟化酶基因启动子的克隆及p53结合元件的初步鉴定

摘要

胆固醇7α-羟化酶（Cholestrol7α-Hydroxylase，CYP7A1）又称胆固醇7α-单氧酶或细胞色素P4507A1酶，属肝脏特异性微粒体细胞色素P450酶系，该酶位于肝细胞内质网膜上，作用是催化胆固醇生成7α-固醇，后者经过固醇核还原、羟化、侧链断裂和加辅酶A等反应生成初级胆汁酸，同时CYP7A1也是此途径的限速酶。大量研究证明，胆固醇-胆汁酸平衡对机体健康具有重要作用，血液胆固醇水平过高会引起高胆固醇血症、动脉硬化、胆结石等疾病，而胆汁酸水平过高则可能会导致胆囊癌、结直肠癌的发生。CYP7A1基因自身多态性、多种核受体、细胞因子、激素共同组成了CYP7A1基因表达的转录激活/抑制级联网络，维持体内胆汁酸-胆固醇平衡及脂质动态平衡。目前该基因在畜禽领域的研究还不够深入，尤其是在转录水平的研究较少。有研究表明，CYP7A1基因表达和P53蛋白在肝脏细胞增殖、脂肪变性及细胞凋亡等过程中可能存在某种协同关系。本研究以鹅为实验对象，成功地克隆了CYP7A1基因启动子区序列，并初步探索了该序列上P53蛋白的结合位点，以及P53蛋白对CYP7A1基因的调控作用。　　 本实验利用基因组步移技术，首次从鹅基因组DNA克隆到CYP7A1基因5'调控区序列，长为2004bp。利用在线软件对所得序列结果进行了序列分析，预测了启动子功能区和转录调控结合位点，其中P53的结合位点有6处。　　 本研究根据CYP7A1基因5'调控区序列成功克隆了一组缺失突变体，将缺失突变体构建重组双荧光素酶报告基因表达载体pGL系列，通过脂质体转染法将重组质粒和pTK-Renilla质粒以及P53真核表达质粒p3XFLAG-P53质粒/空白质粒pET-His质粒共同转入DF-1细胞中，检测不同重组质粒的报告基因表达效率，从而初步确定P53在CYP7A1基因5'调控区的结合位置和调控作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 CYP7A1基因的研究进展

1．1．1 CYP7A1基因的结构特点

1．1．2 CYP7A1基因的表达和调控

1．1．3 CYP7A1基因与代谢疾病的相关研究

1．1．4 展望

1．2 p53蛋白的研究进展

1．2．1 p53蛋白的结构特点

1．2．2 p53蛋白的转录调控

1．2．3 p53蛋白对靶基因的转录激活／抑制功能

1．2．4 突变体p53蛋白

1．2．5 p53蛋白与CYP7A1基因

1．3 真核生物基因启动子序列克隆和功能分析方法

1．3．1 真核生物基因启动子结构

1．3．2 启动子克隆方法的研究进展

1．3．3 启动子分析方法和策略

1．4 本研究的目的和意义

2 CYP7A1基因启动子区域克隆及序列分析

2．1 实验材料

2．1．1 实验鹅品种来源及样品的采集和制备

2．1．2 主要仪器

2．1．3 菌株和克隆载体

2．1．4 主要药品及试剂

2．1．5 常规溶液的配制

2．1．6 引物的设计与合成

2．2 实验方法

2．2．1 碱裂解法提取鹅基因组DNA

2．2．2 引物制备

2．2．3 基因组步移PCR扩增程序

2．2．4 1％琼脂糖凝胶的制作及电泳检测

2．2．5 PCR产物纯化

2．2．6 PCR产物与T5载体连接

2．2．7 连接产物的转化

2．2．8 连接产物的鉴定

2．2．9 所需软件

2．3 结果

2．3．1 CYP7A1基因启动子区的克隆

2．3．2 序列特征分析

2．4 讨论

3 CYP7A1基因5’调控序列p53结合位点的初步研究

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 细胞系

3．1．3 菌株和载体

3．1．4 主要药品和工具酶

3．1．5 试剂盒

3．1．6 主要仪器和设备

3．1．7 引物合成和测序

3．2 实验方法

3．2．1 鹅CYP7A1基因启动子缺失体的构建

3．2．2 引物设计

3．2．3 PCR反应

3．2．4 缺失中间载体构建

3．2．5 提取中间载体质粒DNA

3．2．6 缺失体中间载体的酶切及目的片段的回收

3．2．7 缺失体片段的回收和纯化

3．2．8 连接

3．2．9 重组质粒的转化鉴定

3．2．10 DF-1细胞培养

3．2．11 细胞转染

3．2．12 细胞转染结果检测

3．3 结果

3．3．1 缺失突变体PCR扩增、载体酶切鉴定结果

3．3．2 鹅CYP7A1基因启动子重组质粒的活性测定和分析

3．4 讨论

4 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

个人简介

致谢