巨桉低温胁迫SSH EST文库构建及CBF基因的克隆和表达分析

摘要

桉树原产于澳大利亚，生长迅速，木材用途广泛，且能提取具有药用价值的桉油等，已成为世界上最为广泛种植的阔叶树种之一。在我国，桉树己成为热带和南亚热带地区最重要的速生用材树种。在浙江沿海，桉树可作为沿海防护林和景观绿化树种。但大多数桉树属于冷敏感树种，在气候变化异常的今天，低温常常给桉树种植带来不利影响。为研究桉树抗寒的分子机制，促进其抗寒相关的分子辅助育种，培育高抗品种应对低温危害，本研究以巨桉为材料，利用SSH(suppressjonsubtractivehybridization)技术，构建了其低温胁迫下的EST(expressingsequencetag)差减文库，初步分析了低温诱导的相关基因。同时，针对植物在低温胁迫中起重要作用的CBF基因，用同源克隆的方法在低温处理的巨桉材料中进行了分离。并对克隆得到的巨桉CBF基因进行低温等逆境条件下的表达分析，初步研究了它们在巨桉抗低温等逆境中的功能。本文研究结果为桉树的抗寒遗传改良奠定了理论基础。取得的主要研究成果如下:　　 采用抑制差减杂交技术(SSH)，构建巨桉在低温(4℃)黑暗(Tester)和常温(25℃)黑暗(Driver)条件下处理2h的表达基因差减EST文库。通过对文库的测序，获得了280个高质量序列。经功能注释，发现其中包含脂肪酸去饱和酶基因、信号肽酶和Zn2+依赖蛋白基因等与巨桉低温诱导相关的基因。在文库基因筛选过程中，发现编号为88（脂肪酸去饱和酶基因）和93（锌指蛋白基因）的两个序列，在低温诱导下表达量明显上调，表达量分别为对照的22倍和27倍，说明了文库构建的有效、可用。　　 利用同源克隆方法从低温诱导的巨桉幼苗中克隆到2条CBF的全长cDNA序列，命名为EgrCBF1和EgrCBF2，全长分别为1062bp和1203bp，编码220个氨基酸和196个氨基酸，都包含一个AP2结构域。两个基因编码的蛋白都与冈尼桉中CBF蛋白具有很高的同源性，与EguCBF1a的同源性分别达到了91％和80％。　　 对EgrCBF1和EgrCBF2基因的RT-PCR分析表明，EgrCBF1主要在叶和根中表达，而EgrCBF2在叶、茎和根中都有表达。对不同温度和4℃不同时间处理下EgrCBF1和EgrCBF2的qRT-PCR分析表明，两个基因都受低温诱导，而且随低温时间的延长，它们的诱导表达特性都呈先升后降的趋势。在100μMABA，200mMNaCl和干旱处理下，EgrCBF1受ABA和干旱诱导;EgrCBF2的受干旱和高盐胁迫诱导。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

1．1 桉树生物学特性及其价值

1．1．1 桉树生物学特性

1．1．2 桉树的价值

1．2 植物抗寒基因研究现状

1．2．1 抗寒功能基因的研究现状

1．2．2 CBF基因家族在植物抗逆中的研究现状

1．3 低温胁迫下植物代谢响应机制研究现状

1．3．1 植物内容物对低温的响应

1．3．2 植物代谢相关酶对低温的响应

1．4 抑制性差减杂交技术

1．4．1 抑制性差减杂交技术的原理

1．4．2 抑制性差减杂交技术的基本步骤

1．4．3 抑制性差减杂交技术的优缺点

1．4．4 SSH技术在植物非生物逆境胁迫下基因表达研究中的应用

第二章 低温胁迫下巨桉SSH EST文库构建及差异基因的表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 处理方法

2．1．3 试剂

2．1．4 总RNA的制备

2．1．5 抑制消减杂交

2．1．6 SSH cDNA文库的构建

2．1．7 文库质量鉴定

2．1．8 测序和序列分析

2．1．9 差异表达基因的实时荧光定量RT-PCR

2．2 结果与分析

2．2．1 SSH-cDNA文库的构建

2．2．2 SSH-cDNA文库筛选

2．2．3 文库测序与序列分析

2．2．4 差异表达基因的实时荧光定量RT-PCR结果

2．3 讨论

第三章 巨桉CBF基因EgrCBF1和EgrCBF2的克隆

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 试剂

3．1．3 仪器

3．1．4 桉树总RNA的提取

3．1．5 琼脂糖凝胶电泳检测RNA

3．1．6 反转录cDNA第一链的合成

3．1．7 目的基因全长cDNA的分离

3．2 结果与分析

3．2．1 EgrCBF1和EgrCBF2基因的克隆

3．2．2 EgrCBF1和EgrCBF2蛋白的序列分析

3．3 讨论

第四章 巨桉EgrCBF1和EgrCBF2基因的表达分析

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 试剂

4．1．3 材料的处理

4．1．4 总RNA的提取

4．1．5 EgrCBF基因组织特异性表达分析

4．1．6 冷处理

4．1．7 ABA、干旱和盐处理

4．1．8 实时荧光定量RT-PCR

4．2 结果与分析

4．2．1 巨桉不同器官中EgrCBF1和EgrCBF2的表达分析

4．2．2 不同低温胁迫下EgrCBF1和EgrCBF2表达的变化

4．2．3 4℃不时间处理时EgrCBF1和EgrCBF2基因表达的变化

4．2．4 ABA胁迫下桉树CBF基因表达的变化

4．2．5干旱、盐胁迫下EgrCBFI和EgrCBF2表达的变化

4．3 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

个人简介

致谢