珍稀泌盐植物长叶红砂RtLDOX2基因的克隆及功能分析

摘要

非生物胁迫包括盐、干旱、UV-B等会影响植物的生长发育,植物通过积累次生代谢产物抵抗不同的胁迫,花青素具有极强的抗氧化活性,能够帮助植物免受活性氧的损伤.长叶红砂(Reaumuria trigyna)隶属于柽柳科(Tamarieaceae)琵琶柴属(Reaumuria Linn),是亚洲中部地区东阿拉善-西鄂尔多斯地区特有种,对盐渍荒漠环境具有极强的适应性.本研究从长叶红砂中克隆了一个花青素合成途径中的关键酶基因无色花青素双加氧酶RtLDOX2基因,分析RtLDOX2基因在不同胁迫下的表达特性,构建原核、真核表达载体,将其转入大肠杆菌中进行蛋白纯化,并分析RtLDOX2蛋白的催化活性,转入拟南芥中,分析RtLDOX2对转基因拟南芥在不同非生物胁迫下黄酮类化学物及花青素积累以及植物抗逆性的影响,探索黄酮类化合物花青素的合成对植物抵抗非生物胁迫的调控作用.本研究的主要结果如下:　　(1).从长叶红砂中克隆了RtLDOX2基因的ORF,大小为1074bp,编码357个氨基酸,蛋白分子量约为39.90kDa;理论等电点为5.62.结构分析显示RtLDOX2基因包含3个外显子和2个内含子.氨基酸序列比对分析发现,RtLDOX2含有两个保守的结构域,与之前研究发现的RtLDOX相比,多了一个2-酮戊二酸和Fe2+依赖性加氧酶超家族保守结构域.系统进化树结果显示,RtLDOX2与天蓝遏蓝菜、菠萝、小兰屿蝴蝶兰蛋白亲缘关系最近,聚为一类,而与RtLDOX亲缘关系较远,没有聚为一类.利用染色体步移技术克隆了该基因的启动子序列,分析其含有G-box、MRE、ABRE、ERE等逆境胁迫响应元件.　　(2).组织特异性分析显示RtLDOX2基因在长叶红砂根茎叶中均有表达,根和叶中表达量较高,茎中表达量较低.NaCl、PEG、4oC、H2O2、ABA不同非生物胁迫均能诱导RtLDOX2基因的表达.　　(3).构建RtLDOX2原核表达载体,转化大肠杆菌表达菌中,诱导纯化RtLDOX2重组蛋白.体外催化实验发现RtLDOX2具有FLS的催化活性,能够催化二氢山奈酚形成山奈酚,不能催化柚皮素、二氢槲皮素和二氢杨梅素三种底物.　　(4).构建RtLDOX2真核表达载体,转化拟南芥,分别进行NaCl、干旱、UV-B和蔗糖胁迫处理,发现转基因拟南芥的根长、鲜重和叶绿素含量均明显高于WT.NaCl、干旱、UV-B胁迫下转基因拟南芥中脯氨酸、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性以及花青素和总黄酮的含量均显著高于WT,MDA、H2O2、PA的含量均显著低于WT.对胁迫相关基因的表达量检测发现,胁迫后转基因植株的抗氧化相关基因,离子转运相关基因以及脯氨酸合成相关基因的表达量均显著高于WT.表明在多种非生物胁迫下,RtLDOX2通过增加花青素的含量,提高植物的抗氧化能力和渗透调节能力,从而增强其对非生物胁迫的耐受性.

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摘 要

ABSTRACT

第一章前言

1.1黄酮类化合物的研究进展

1.1.1黄酮类化合物的种类及合成途径

1.1.2黄酮类化合物的药理功能

1.1.3黄酮类化合物在植物生长发育中的作用

1.1.4黄酮类化合物在植物抵抗生物胁迫中的作用

1.1.5黄酮类化合物在植物抵抗非生物胁迫中的作用

1.1.6黄酮类化合物合成途径响应非生物胁迫的分子调控机制

1.1.7转录因子对黄酮类化合物合成途径的调控

1.2花青素的研究进展

1.2.1花青素的结构及合成途径

1.2.2花青素在植物生长发育中的作用

1.2.3花青素在植物抵抗生物胁迫中的作用

1.2.4花青素在植物抵抗非生物胁迫中的作用

1.2.5花青素合成途径响应非生物胁迫的分子调控机制

1.2.6转录因子对花青素合成途径的调控

1.3无色花青素双加氧酶（LDOX）研究进展

1.3.1无色花青素双加氧酶（LDOX）的催化反应机制

1.3.2无色花青素双加氧酶（LDOX）的功能

1.4长叶红砂的研究进展

1.4.1长叶红砂的形态结构及生物学特征

1.4.2长叶红砂耐盐分子机制的研究

1.5研究意义及技术路线

1.5.1研究意义

1.5.2技术路线

第二章长叶红砂RtLDOX2基因的克隆及生物信息学分析

2.1实验材料

2.1.1植物材料、菌种和质粒

2.1.2 实验试剂

2.2实验方法

2.2.1长叶红砂幼苗培养

2.2.2 RtLDOX2基因ORF的扩增

表2.1RtLDOX2基因ORF的扩增体系

Table2.1PCR amplification system of RtLDOX2 ORF

表2.2 RtLDOX2基因菌液PCR体系

Table2.2 PCR system of RtLDOX2

2.2.3RtLDOX2基因结构分析

2.2.4RtLDOX2基因生物信息学分析

2.2.5 RtLDOX2基因启动子区的克隆

表2.3 RtLDOX2启动子引物序列

Table2.3 RtLDOX2 Promoter Primer Sequences

2.3结果与分析

2.3.1RtLDOX2基因的克隆

2.3.2RtLDOX2基因结构分析

2.3.3RtLDOX2基因的生物信息学分析

图2.3 RtLDOX2的ORF及推测的氨基酸序列

Fig 2.3 The ORF of RtLDOX2 and the putative amino

图2.4 亲/疏水性分析

Fig 2.4 The Hydrophilicity/hydrophobicity analysis

图2.5 二级结构预测

Fig 2.5 The predfction of seconary stucture

图2.6 信号肽预测

Fig 2.6 The predfction of signal peptide

图2.7 跨膜结构域预测

Fig 2.7 The predfction of transmembrane domain

图2.9 RtLDOX2蛋白保守结构域预测

Fig. 2.9 Schematic of the domain structure of RtLD

LDOX：Noccaea caerulescens（JAU16548.1）, Gossypium a

2.3.4RtLDOX2启动子的克隆及分析

2.4讨论

第三章 RtLDOX2基因表达特性及蛋白催化活性分析

3.1实验材料

3.1.1实验植物

3.1.2菌种和质粒

3.1.3实验试剂

3.2实验方法

3.2.1RtLDOX2基因表达分析

3.2.2RtLDOX2基因原核表达载体的构建及大肠杆菌转化

3.2.3 RtLDOX2重组蛋白的体外活性鉴定

3.3结果与分析

3.3.1 RtLDOX2基因表达特性分析

3.3.2 RtLDOX2原核表达载体的构建

3.3.3 pET32a-RtLDOX2重组蛋白诱导表达及纯化

3.3.4RtLDOX2重组蛋白体外活性分析

3.4讨论

第四章 长叶红砂RtLDOX2基因的功能分析

4.1实验材料

4.1.1实验植物

4.1.2菌种和质粒

4.1.3实验试剂

4.2实验方法

4.2.1 RtLDOX2基因真核表达载体的构建及农杆菌转化

4.2.2转基因拟南芥的获得、筛选及鉴定

4.2.3RtLDOX2转基因拟南芥的抗逆性分析

4.3结果与分析

4.3.1RtLDOX2真核表达载体的构建

4.3.2 RtLDOX2转基因拟南芥的筛选

4.3.3盐胁迫条件下RtLDOX2转基因拟南芥的耐受性分析

4.3.4干旱胁迫条件下RtLDOX2转基因拟南芥的耐受性分析

4.3.5 UV-B胁迫条件下RtLDOX2转基因拟南芥的耐受性分析

4.3.6蔗糖处理下RtLDOX2转基因拟南芥的耐受性分析

4.4讨论

第五章 结论

参考文献

致谢