人类ZO-1蛋折第二个PDZ结构域的溶液结构与功能

摘要

细胞连接是存在于多细胞动物细胞间的一种特化结构，多存在于上皮组织。在脊椎动物上皮组织中，主要有三类细胞连接：紧密连接，粘性连接和间隙连接。每一种连接在形态、位置与功能上都各有不同。紧密连接在位置上是这三种连接中最靠近极性上皮细胞顶膜的，也是将相邻细胞的细胞膜连接得最为紧密的。功能上紧密连接负责控制小分子和离子在胞间通路的通过，同时作为屏障阻碍细胞侧膜内的膜蛋白在细胞项膜和基底膜之间的流动从而维持上皮细胞的极性。粘性连接在位置上位于紧密连接之下，对相邻细胞的连接也没有紧密连接那么紧，粘性连接处相邻细胞间距为10-20纳米。缝隙连接又称通讯连接，通过由Connexin组成的六聚体Connexon彼此对接形成胞间通道，从而参与突触电信号的传递和胞间营养物质的共享等重要生命活动。
　　 ZO-1蛋白首先在紧密连接中被发现，它在细胞膜处同构成紧密连接的主要的跨膜蛋白Claudin，Occludin以及JAM等都有相互作用，在胞内又同细胞骨架蛋白以及一些核酸结合蛋白相互作用。ZO-1在紧密连接的建立和细胞内信号的传递方面起着重要的调节作用。在缺乏紧密连接的细胞中也发现了ZO-1蛋白，如粘性连接处和缝隙连接处。在粘性连接处，ZO-1同Catenin等有相互作用；在缝隙连接处，ZO-1同多种连接子蛋白Connexin相互作用，调节Connexin在细胞质和细胞膜之间的平衡分布进而调控缝隙连接斑块的大小。
　　 我们的工作中，利用核磁共振波谱学(NMR)的方法解析了人类ZO-1蛋白第二个PDZ结构域(Z01PDZ2)的溶液结构。Z01PDZ2为结构域交换的二体，通过将二体中每条多肽链N端的20个残基彼此交换形成非常稳定的同二聚体。这种同二聚体保留了PDZ结构域同配基相互作用所需要的位于a2与β2之间的疏水口袋。
　　 我们利用NMR化学位移扰动的方法以及等温量热实验进一步研究了Z01PDZ2同其配基的相互作用。我们发现Z01PDZ2表现出了II型PDZ结构域的结合特征，选择同C端O位和-2位为疏水氨基酸残基的小肽相互作用。同时，我们确认了Cx45可以通过它的C端同ZO-1相互作用，并将之前认为的Cx45的作用范围，即PDZI-PDZ2精确到了PDZ2。此外，我们还发现Z01PDZ2可以同Cx25和Cx59的C端小肽相互作用，这两种相互作用是没有文献报道过的，它们的生理学意义还有待进一步的发掘。
　　 通过插入突变实验，我们成功的在Z01PDZ2的第22位异亮氨酸之前插入了1-6个氨基酸不等。其中，当插入氨基酸达到3个或3个以上时，Z01PDZ2会由同二聚体突变成单体。分子量的确定是通过快速蛋白液相色谱法和沉降速率分析型超离心法完成的。插入突变导致的二体变为单体为我们揭示出了Z01PDZ2形成二体构象而非经典PDZ结构域单体构象的原因。第22位异亮氨酸位于Z01PDZ2按经典PDZ结构域定义的β2和β3之间，这里的残基较其他PDZ结构域数量上少，形成转角较难。因此β2同β3没有形成反平行的折叠片，而形成了一条连续的两倍长度的β链。Z01PDZ2突变后的单体保留了同Cx43的相互作用，但相互作用强度大大减弱；同时该突变体不再能够同Z02PDZ2以及Z03PDZ2相互作用。
　　 找到了Z01PDZ2形成二体的原因有利于我们进一步研究Z01PDZ2在细胞内的功能。我们构建了全长ZO-1的突变体，该突变体的PDZ2结构域被引入了如前所述的插入突变，因此ZO-1突变体不再能够通过其PDZ2二聚。MDCK细胞在紧密连接建立初期，其跨膜电阻(TER)曲线呈迅速增高再回落的特点，而ZO-1缺失的细胞的TER曲线则一直较为平缓。利用RNA干扰方法我们抑制了MDCK细胞内源ZO-1的表达，再将野生型ZO-1及其突变体分别转染到内源ZO-1被沉默的MDCK细胞中。我们发现，内源ZO-1表达的缺失导致TER曲线一直较为平缓，而外源野生型ZO-1的表达使得平缓TER曲线恢复了迅速增高再回落的特点，但ZO-1突变体没有这个能力。因此，我们认为ZO-1蛋白中其PDZ2结构域的二聚对于紧密连接的建立是必须的。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 紧密连接

1.1.1 紧密连接的构成

1.1.2 紧密连接的功能

1.1.3 紧密连接和疾病

1.2 粘性连接

1.2.1 CadIlerin

1.2.2 Cadherin-Catenin复合物

1.2.3 Cadherin同Nectin的合作

1.3 缝隙连接（通讯连接）

1.3.1 缝隙连接胞间通道的动态调节

1.3.2 缝隙连接的总体功能

参考文献

第二章 ZO-1蛋白第二个PDZ结构域的溶液结构和功能

2.1 ZO-1蛋白及PDZ结构域介绍

2.1.1 ZO-1蛋白

2.1.2 PDZ结构域

2.2 实验材料与方法

2.2.1 目的基因的获得

2.2.2 表达质粒的构建

2.2.3 突变表达质粒的构建

2.2.4 共表达菌株的构建

2.2.5 重组蛋白的表达与纯化

2.2.6 蛋白质分子量的鉴定

2.2.7 蛋白质浓度测定

2.2.8 Pull-down实验

2.2.9 细胞培养和转染

2.2.10 免疫印迹

2.2.11 免疫荧光(Immunofluorescence)

2.2.12 钙转换(Calcium switch)和跨细胞上皮电阻值(TER)的测量

2.2.13 小肽的合成与纯化

2.2.14 等温量热(ITC)实验

2.2.15 NMR化学位移扰动实验

2.2.16 NMR结构测定

2.3 实验结果和讨论

2.3.1 Z01PDZ2结构域的溶液结构解析

参考文献

附录 核磁谱图解析方法

谱图处理

核磁滴定实验结果分析

主链认证

侧链认证

NOESY认证及结构计算

15N主链迟豫实验

NMR相关软件在linux系统下的安装

NMRPipe安装：

Talos+安装：

csi2.0安装：

Sparky3.112安装：

Chimera安装：

CNS l.2安装：

Cyana安装：

Procheck NMR安装：

Molmol2K2安装：

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果

致谢