人源CFIm复合物识别pre-mRNA的分子机制及酵母Pub1蛋白结构的生物学研究

摘要

本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。
　　 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入《中国学位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。
　　 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。
　　 作用。Publ可在体外结合多聚尿嘧啶。我们成功解析Publ-RRM2和连续RRM结构域Publ-RRMl-RRM2(Publ-RRM12)的结构。Publ-RRM1和Publ-RRM2具有典型RRM结构域的结构。结构生物学研究发现Publ-RRM12中两个RRM结构域通过一段linker相连，结构域之间没有相互作用。Publ-RRM12的晶体结构显示，Publ-RRM12是一个CV-N类型domain-swapped二聚体。Publ-RRM12与晶胞内的对称分子相互作用稳定了两个RRM结构域的空间位置。进一步研究发现Publ-RRM12在溶液中是以单体形式存在的。通过点突变实验，我们确定了Publ-RRM1和Publ-RRM2结合多聚尿嘧啶的结合面及关键氨基酸残基。利用SPR技术，我们测定了三个RRM结构域和Publ-RRM12结合10个和15个碱基多聚尿嘧啶的亲和力。结果显示Publ的单个RRM结构域以相似的亲和力结合这两条多聚尿嘧啶。但是Publ-RRM12结合15个碱基多聚尿嘧啶的亲和力显著高于10个碱基。这些研究结果为了解Publ蛋白提高了结构生物学和生物化学的基础。

目录

文摘

英文文摘

第1章 绪论

1.1 pre-mRNA的3’-端加工因子的研究进展

1.1.1 pre-mRNA的加工成熟过程

1.1.2 pre-mRNA的3’-端加工的重要性

1.1.3 哺乳动物pre-mRNA的调控3'-端加工的序列元件

1.1.4 pre-mRNA 3'-端加工装置及蛋白因子

2.1 RNA识别结构域的结构与功能

2.1.1 什么是RRM结构域？

2.1.2 RRM结构域的结构

2.1.3 RRM-RNA复合物结构

2.1.4 RRM结构域具有高度可塑性从而获得高亲和力和特异性

2.1.5 RRM结构域同样也参与蛋白一蛋白相互作用

第2章 CFIm复合物识别Pre-mRNA的分子机制研究

2.1 CFIm复合物的功能研究及结构生物学研究现状

2.2 实验材料和方法

2.2.1 基因克隆和表达质粒构建

2.2.2 CFIm25-CFIm68RRM复合物表达和纯化

2.2.3 晶体生长和衍射数据收集

2.2.4 模型构建和结构修正

2.2.5 CFIm25-CFIm68RRM复合物的生化性质与RNA结合能力鉴定

2.3 实验结果

2.3.1 CFIm25与CFIm68相互作用的研究

2.3.2 CFIm25-CFIm68RRM复合物的纯化

2.3.3 CFIm25-CFIm68RRM的结构解析

2.3.4 CFIm25-CFIm68RRM的总体结构

2.3.5 CFIm68RRM的结构

2.3.6 CFIm25与CFIm68RRM的相互作用界面

2.3.7 CFIm25-CFIm68RRM-RNA的结构解析

2.3.8 UGUAA的识别

2.3.9 突变实验数据支持这个新颖的结合模式

2.3.10 RNA结合能力分析

2.3.11 不同种属多细胞动物多聚信使RNA序列的统计学分析

2.4 结果讨论

2.4.1 与其他RRM-蛋白复合物结构的比较

2.4.2 CFIm25二聚化的重要性

2.4.3 CFIm25通过稳定CFIm68的L3 loop构象来使其结合RNA

2.4.4 CFIm68对于pre-mRNA识别的重要性

第3章 PUB1的结构与功能研究

3.1 Pub1的生物学功能

3.2 实验材料和方法

3.2.1 基因克隆和表达质粒构建

3.2.2 蛋白表达和纯化

3.2.3 晶体生长和衍射数据收集

3.2.4 模型构建和结构修正

3.2.5 Publ生化性质和RNA结合能力鉴定

3.3 实验结果与讨论

3.3.1 Publ-RRM2和PubI-RRMI2表达质粒构建，蛋白表达、纯化

3.3.2 Publ-RRM2的晶体学研究

3.3.3 Publ-RRM12的晶体学研究

3.3.4 Publ-RRMI和PubI-RRM2的结构

3.3.5 与其它RRM结构域机构的比较

3.3.6 Publ-RRM1和Publ-RRM2的RNA结合面及关键氨基酸残基

3.3.7 Publ-RRM12的结构

3.3.8 poly(U)结合能力的测定

3.3.9 Publ-RRM12结合poly(U)的的可能模式

3.3.10 Publ识别poly（U）的可能机制

3.3.11 小结

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文与取得的其他研究成果