PanIn-3和胰腺癌中异常表达的miRNAs的筛查、验证及miR-1290在胰腺癌中的作用与机制研究

摘要

背景:　　胰腺癌是一种较为常见的高度恶性的消化系统肿瘤，其五年生存率不足5％，中位生存期小于6个月。胰腺癌最常见的组织学类型为胰腺导管腺癌(PDAC)，约占所有胰腺癌病例的85％-90％。患者死亡率高、预后差的主要原因是该疾病早期缺乏特异性临床症状和诊断及预后相关的分子标志物，大部分患者在诊断时肿瘤已发生转移，从而失去了手术机会,而且该肿瘤对放、化疗反应性差，极易复发转移。近年来，随着医学的发展，人类大多数恶性肿瘤患者的生存期有了显著增加，但胰腺癌患者的生存期并无明显改善，因此胰腺癌早期诊断及治疗成为亟待解决的问题。研究显示，胰腺上皮内瘤变（PanIN），尤其是高级别上皮内瘤变(PanIN-3)，是胰腺导管腺癌最常见的非侵袭性癌前病变。早期诊断和手术切除可将胰腺癌患者的生存率由Ⅳ期的6％提高到Ⅰ期的50％左右。若能找到胰腺癌特异性的分子标志物并在癌前病变阶段对该疾病进行诊断或有针对性的对胰腺癌高危人群进行筛查，胰腺癌患者的生存状况将会得到大大改善。此外，胰腺癌的发生发展涉及多种癌基因、抑癌基因以及表观遗传学等改变，探索胰腺癌的发病机制，将为胰腺癌诊断治疗提供新的思路。　　MicroRNA(miRNA)是一组内源性的非编码的单链小RNA分子，长度为19-24个核苷酸，主要通过与其靶标mRNA的3'UTR区域互补结合，导致mRNA的降解或翻译的抑制，在转录后水平调节30％的蛋白质编码基因的表达而发挥作用。一个miRNA可能对应多个靶点，同时，多个miRNA也可能作用于同一个靶点。miRNA的异常表达与多种肿瘤发生发展的重要过程息息相关，例如胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等。目前研究表明，miR-21，miR-155，miR-196a和miR-210在胰腺癌的发生发展中发挥重要作用，或可作为胰腺癌潜在的分子标记物。然而多种研究中特异性miRNAs的一致性较差，应用中其敏感性和特异性仍有待提高。因此，本研究主要致力于发现更有优势的胰腺癌尤其是PanIN-3特异性的miRNAs并探索其作用机制，为胰腺癌的诊断、治疗和预后判断提供新的切入点。　　目的:　　筛查PanIN-3及胰腺癌组织中异常表达的miRNAs，并在胰腺癌组织和外周血浆中进行验证，研究其对胰腺癌生物学特性的影响，并分析其相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性，再通过生物信息学方法寻找并鉴定其下游作用的靶基因，进一步探寻其作用机制。　　方法:　　1.利用miRNA芯片技术筛查PanIN-3及胰腺癌组织中较胰腺正常导管及低级别上皮内瘤变组织中显著差异表达的miRNAs。　　2.利用原位杂交和实时荧光定量PCR技术，在胰腺癌患者石蜡包埋组织和外周血浆中进一步验证上述miRNAs的表达情况，获得可能作为诊断标志物的候选miRNAs，并分析其诊断效能。　　3.结合胰腺癌患者临床病理资料，分析候选miR-1290的相对表达量与胰腺癌临床病理指标间的相关性。　　4.通过细胞学实验:观察miR-1290对胰腺癌细胞株生长、增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学特性的影响。　　5.通过动物实验:研究miR-1290对胰腺癌裸鼠皮下荷瘤模型肿瘤生物学特性的影响。　　6.利用生物信息学(MiRDB，Targetscan，MiRanda)分析技术，预测miR-1290可能的下游靶基因，并利用双荧光素酶报告基因系统分析其与miR-1290的关系，并进一步验证其对胰腺癌生物学行为的影响。　　7.利用实时荧光定量PCR、Western Blot以及免疫组织化学技术，分析miR-1290及其靶基因在胰腺癌及癌旁正常组织中的表达情况，探讨其临床意义。　　结果:　　1.miRNA芯片结果显示:与正常胰腺导管上皮和低级别上皮内瘤变相比，PanIN-3和胰腺癌中表达明显上调或者下调（超过5倍）的miRNAs有30余种，结合文献，筛选出其中的19条作为候选miRNAs。其中上调的主要有miR-31-5p，miR-29a-5p，miR-21-5p,miR-200b-3p,miR-192-5p,miR-146b-5p,miR-1290,miR-101-3p,1et-7a-5p,miR-196a-3p，miR-29a-3p，miR-34a-3p，miR-155;下调的主要有miR-105-3p，miR-216a-5p,miR-218-2-3p,miR-34a-5p,miR-513c-3p和miR-887。　　2.原位杂交结果显示:以“PanIN-3和癌组织中表达明显高于正常导管上皮和低级别上皮内瘤变(PanIN-1和PanIN-2)”作为判定标准，筛选出高表达的miRNAs共计6条，包括miR-31-5p，miR-101-3p，miR-1290，miR-34a-3p，miR-21-5p以及miR-155。　　3.血浆实时荧光定量PCR验证结果显示:胰腺癌患者外周血浆中，miR-21-5p、miR-31-5p、miR-155和miR-1290表达均明显增高，差异具有统计学意义。绘制ROC曲线比较其诊断效能，miR-31-5p和miR-1290具有相对较好的诊断效能，AUC分别为0.848和0.829。　　4.组织实时荧光定量PCR验证结果显示:miR-31-5p和miR-1290均在胰腺导管腺癌组织中高表达，癌旁正常组织低表达，与外周血浆结果相一致，提示miR-31及miR-1290可能是参与高级别上皮内瘤变向胰腺癌转变这一过程的早期分子，具有成为胰腺癌早期诊断分子标志物的潜能。结合患者的临床病理资料进一步发现miR-1290高表达与肿瘤的分化程度和淋巴结转移密切相关(p＜0.05)，而与年龄、性别、肿瘤大小等因素无关。提示miR-1290可能参与肿瘤的侵袭转移。　　5.miR-1290对胰腺癌细胞株生物学特性的影响:(1)检测五株胰腺癌细胞株中miR-1290的表达量，发现其在AsPC-1中表达最低，在PANC-1中表达最高，选取这两株细胞分别进行过表达和抑制实验。(2)验证转染效果:转染miR-1290Agomir的细胞系中，miR-1290被成功过表达，转染miR-1290Antagomir的细胞系中，miR-1290被成功抑制。(3)平板克隆实验结果显示，过表达miR-1290可显著促进细胞增殖和集落形成(p＜0.05)。(4)细胞增殖活性实验结果显示，miR-1290过表达，细胞增殖速度加快，24小时活细胞数量明显高于对照组(p＜0.05);miR-1290抑制后，细胞增殖速度减慢，24小时活细胞数量明显少于对照组(p＜0.05)。(5)细胞迁移及侵袭实验结果显示，过表达miR-1290可促进胰腺癌细胞迁移和侵袭(p＜0.05);抑制miR-1290，细胞迁移和侵袭能力显著下降(p＜0.05)。与细胞划痕实验趋势一致。(6)凋亡实验结果显示，过表达或抑制miR-1290对细胞凋亡无明显影响(p＞0.05)。　　6.裸鼠皮下荷瘤实验结果显示:过表达miR-1290可增加胰腺癌细胞成瘤能力，形成的肿瘤体积更大(p＜0.05）;抑制miR-1290可减弱胰腺癌细胞成瘤能力，形成的肿瘤体积减小(p＜0.05)。　　7.生物信息学结果显示，IKKα可能为miR-1290的靶基因之一。　　9.IKKα对胰腺癌细胞功能学实验结果显示:(1)抑制IKKα在胰腺癌细胞系中的表达，可促进其增殖、迁移和侵袭;(2)过表达IKKα，可逆转miR-1290对胰腺癌细胞系促增殖、迁移和侵袭的作用;(3)改变胰腺癌细胞系中miR-1290及IKKα的表达量，NF-κB信号通路相关的蛋白IKBα、P65和P50表达无明显变化。　　结论:　　1.通过miRNA芯片、原位杂交以及组织和血浆中差异性表达miRNAs的筛查，6条miRNAs:miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p和miR-155在PanIN-3及胰腺癌中表达升高。　　2.胰腺癌组织中差异性表达的miRNAs与胰腺癌患者血浆中差异性表达的miRNAs具有一致性，提示血浆中miRNAs有望成为胰腺癌诊断、治疗和预后评估的分子标志物。　　3.miR-1290在胰腺癌组织及胰腺癌患者外周血浆中表达均显著升高，且其表达水平与胰腺癌患者肿瘤分化程度及淋巴结转移相关，提示miR-1290可能成为胰腺癌诊断及预后判断的分子标志物。　　4.miR-1290可通过促进胰腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及成瘤能力，参与胰腺癌生物学行为的调控，其在胰腺癌发生发展中可能起着癌基因的作用。　　5.IKKα可能是miR-1290的靶基因之一，其可直接被miR-1290抑制（结合位点为3'端843-849处），促进胰腺癌的增殖、迁移和侵袭，提示miR-1290及其靶基因IKKα可能成为胰腺癌诊断和治疗的新靶点。　　6.IKKα作为miR-1290靶基因之一参与胰腺癌发生发展，可能通过非NF-κB依赖的信号通路发挥作用。

目录

声明

摘要

缩略词

前言

参考文献

第一部分 PanIN-3及胰腺癌中异常表达microRNAs的筛查及验证

一、引言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第二部分 miR-1290对胰腺癌生物学行为的影响

一、引言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第三部分 miR-1290下游靶基因的预测、鉴定和验证

一、引言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

参考文献

文献综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢