系统性红斑狼疮B细胞亚群特点及免疫组库分析

摘要

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种病因未明的慢性全身性自身免疫性疾病，以B细胞免疫耐受破坏、产生大量自身抗体为特征，最终免疫复合物沉积于组织、器官从而导致损伤。我国SLE患病率约为0.7～1/1000，且女性的发病率远高于男性。尽管各类固有免疫和适应性免疫细胞共同参与SLE的发病机制，根据目前小鼠和人的研究，B细胞免疫耐受破坏与自身反应性B细胞异常激活仍是SLE发病的核心致病因素。　　SLE患者体内B细胞亚群比例失调，免疫稳态存在紊乱，检测其外周血B细胞亚群的比例和功能状态，可以深入探讨不同B细胞亚群在SLE发病中的作用。SLE患者体内存在大量的自身反应性抗体分泌细胞(Antibody secreting cells，ASC)和高水平的自身抗体，并且ASC细胞的比例扩增会引起SLE疾病活动度的增高，然而这种致病性ASC细胞的来源和产生过程目前仍不清。无能B细胞（人外周血中的无能B细胞称为B№细胞）是初始B细胞中富含自身反应性的一个亚群，其通过下调表面免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M来避免接受抗原刺激，从而达到免疫“无能”的状态。此外，其胞内的蛋白磷酸化水平和钙流反应性处于抑制状态。多项研究表明无能B细胞在自身免疫疾病中缺失，提示着这群细胞可能发生激活并得到进一步分化。无能B细胞很可能是SLE患者致病性ASC细胞的潜在危险来源。　　免疫组库测序（Adaptive immune receptor repertoire sequencing，AIRR-seq）是研究B细胞特征和抗体谱特点的重要方法，通过高通量测序方法分析B细胞受体(B cell receptor，BCR)序列可以探究适应性免疫谱多样性、克隆扩增和免疫谱成熟过程，进一步加深对SLE中异常免疫反应的了解，也有助于寻找致病性的B细胞亚群。然而SLE患者体内B细胞亚群的免疫组库仍缺乏研究，IgM-的BND细胞、IgM+的初始B细胞(Conventional Naive B cells，CN B)免疫组库特点和类型转换的记忆B细胞（Switch MemoryBcell，SMB）以及ASC细胞关系仍然未知。自身反应性B细胞如何被激活并转化为ASC细胞仍是有待于解决的重要难题。　　本课题首先通过流式细胞术检测SLE患者B细胞亚群比例及其功能状态，探讨各B细胞亚群在SLE发病中的意义。其次，通过分选IgM+的CNB细胞、IgM-的BND细胞、SM B细胞以及ASC细胞。并对4个B细胞亚群进行免疫组库分析，进而探讨SLE中4种细胞亚群的相互关系，协助寻找SLE中的致病性细胞产生来源和转化过程。　　第一章 SLE患者外周血中B细胞亚群的比例与功能研究　　目的:　　研究SLE患者B细胞不同亚群的比例与功能特点。　　方法:　　1.密度梯度离心法分离61例SLE患者和61例健康对照的外周血单个核细胞(Peripheral blood monocyte cells，PBMC)，采用流式细胞术标记不同B细胞亚群表面标记，对各细胞亚群比例进行统计分析，并进行临床相关性分析。　　2.采用流式细胞术，检测不同B细胞亚群表面CD21、CD40、CD80、CD24、CD95、CD183、白介素4受体(Interleukin4receptor，IL-4R)、B细胞激活因子受体(B-cell activating factor，BAFF-R)的表达。　　3.使用MitoTracker⑧Green探针标记B细胞活化线粒体，判断不同B细胞亚群线粒体活化状态。　　4.检测初始B细胞(CN B、BND)在BCR刺激情况，胞内钙流水平的变化。　　结果:　　1.SLE患者B细胞亚群紊乱，双阴性B细胞(Double negativeB cell，DN B)、ASC、过渡性B细胞(Transitional Bcells，TrB)比例相对健康对照增多，非类型转换的记忆B细胞(Unswitch-MemoryB cells，UM B)、BND细胞比例相对健康对照比例减少，而初始B细胞、CNB、SMB细胞比例相对健康对照差异无统计学意义。　　2.ASC细胞比例与系统性红斑狼疮活动度指数(Systemic lupus erythematosus activity index，SLEDAI)、抗双链DNA(Double-strand DNA，dsDNA)抗体滴度均呈显著正相关，BND细胞比例与SLEDAI、抗dsDNA滴度均呈显著负相关，TrB细胞比例与抗dsDNA滴度呈显著负相关。　　3.BND细胞相对CNB细胞活化标志物CD21、CD80、CD95、CD183水平表达降低，CD40、BAFF-R表达相似，而IL-4R表达增加。　　4.SLE患者初始B细胞(CNB、BND)相对健康对照线粒体活化程度增加。　　5.SLE患者BND细胞钙流反应相对健康对照增加。　　结论:　　SLE患者BND细胞比例相对健康对照降低，且与SLEDAI、抗dsDNA滴度呈显著负相关，是一群有重要临床意义的细胞亚群。此外，SLE患者BND细胞相对健康对照线粒体活化程度增加、钙流反应增加，表明SLE患者BND细胞功能活化且对抗原刺激反应性增高，提示SLE患者的BND细胞可能由于功能活化，存在一定程度的激活，引起比例减少。　　第二章 SLE患者CN B、BND、SM B和ASC细胞亚群免疫组库分析。　　方法:　　1.密度梯度离心法分离7例SLE患者和7例健康对照的PBMC，采用流式细胞术标记不同B细胞亚群表面标记。　　2.根据表面标记，流式分选SLE患者和健康对照的IgM+CN B、IgM-BND、SM B和ASC细胞。　　3.Trizol法抽提不同细胞群RNA，进行反转录，并对重链进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增，对PCR产物进行鉴定，回收目的片段条带，对目的片段再次进行PCR扩增。　　4.对PCR产物进行二代测序，测序数据采用MIXCR和VDJtool软件进行序列比对和统计分析。　　结果:　　1.健康人群CN B和BND细胞具有相似的IGHV基因，CN B、BND细胞IGHV4-34基因使用率均显著高于SMB、ASC细胞;SLE患者SM B、ASC细胞相对健康对照IGHV4-34基因使用率增高。　　2.健康人群CNB细胞IGHJ6基因使用率低于BND细胞，CNB、BND细胞IGHJ6基因使用率均显著高于SM B、ASC细胞;SLE患者BND细胞相对健康对照IGHJ6使用率减少，而ASC细胞相对健康对照增加。　　3.健康人群CN B细胞的互补决定区3（Complementary decision region3，CDR3）长度短于BND细胞，CN B、BND细胞CDR3长度均长于SM B、ASC细胞。SLE患者BND细胞相对健康对照CDR3长度减少，而SM B细胞相对健康对照增加。　　结论:　　健康人群中BND细胞相对CN B细胞自身反应性增加，表现在更高的IGHJ6基因使用率和更长的CDR3长度。从初始B细胞(CNB、BND)转变为SMB、ASC细胞，机体的免疫耐受检查点会对自身反应性B细胞筛选，导致IGHV4-34基因使用率下降、IGHJ6基因使用率下降以及CDR3长度减少。我们的结果证明:SLE患者体内免疫耐受检查点缺陷，BND细胞亚群IGHJ6基因使用率低于健康对照、CDR3长度减少。而SM B和ASC细胞亚群IGHJ6、长CDR3等自身反应性序列增加。提示部分BND亚群中的自身反应性B细胞在SLE患者体内可能发生激活，转换为SMB或ASC细胞，成为致病性B细胞。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章系统性红斑狼疮B细胞亚群特点

一、引言

二、材料

(一)研究对象

(二)主要试剂

(三)主要仪器

三、实验方法和步骤

(一)密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)

(二)PBMC流式染色及B细胞亚群比例分析

(三)CNB细胞与BND细胞活化标志物检测

(四)B细胞亚群线粒体活化程度分析

(五)初始B细胞磁珠分选

(六)流式细胞术检测外周血初始B细胞的钙流水平

四、统计与分析

(一)B细胞亚群流式设门方法

(二)SLE患者各B细胞亚群比例分析

(三)SLE患者各B细胞亚群比例相关性分析

(四)BND细胞亚群表型特点

(五)SLE患者初始B细胞线粒体活化程度增高

(六)SLE患者BND细胞钙流反应增加

六、讨论

第二章系统性红斑狼疮B细胞亚群免疫组库分析

二、材料

(一)检测对象

(二)主要试剂

(三)主要仪器

三、实验方法和步骤

(一)密度梯度离心法分离人PBMC

(二)PBMC流式染色及分选

(三)RNA提取

(四)一步法PCR扩增BCR文库

(五)PCR产物凝胶电泳

(六)PCR产物回收

(七)第二轮PCR

(八)PCR产物回收

(九)第三轮PCR

(十)二代测序

(十一)BCR组库分析

四、统计与分析

(一)SLE患者和健康对照各B细胞亚群IGHV基因使用频率

(二)SLE患者和健康对照各B细胞亚群IGHJ基因使用频率

(三)SLE患者和健康对照各B细胞亚群CDR3特点

六、讨论

全文总结

参考文献

文献综述

在读期间发表文章

致谢