长链非编码RNA A-30-P01019163调控卵巢颗粒细胞βB2晶体蛋白功能

摘要

【研究目的】　　卵巢发育不良是造成排卵障碍的一个重要因素。影响卵巢发育的原因有很多，具体作用机制尚不明确。在影响卵巢发育不良的因素中，卵巢中颗粒细胞的因素占了主要原因。我们实验室具有晶体蛋白β B2(CryBB2 )基因敲除小鼠模型，课题组前期研究结果发现CryBB2全敲雄性小鼠生殖功能的降低，可能是由于生殖细胞增殖和凋亡的紊乱。另一方面，我们在对CryBB2 蛋白对卵巢初步作用研究过程中发现，CryBB2蛋白表达于正常人及小鼠的卵巢中，并且在小鼠的卵巢颗粒细胞中表达，且CryBB2基因敲除小鼠的卵巢结构及功能显著有别于正常同龄小鼠卵巢。我们用基因芯片、生物 信 息 学 分 析 及 实 时 定 量 PCR 等 方 法 筛 选 、 验 证 了 LncRNA A-30-P01019163(Lnc-9163) 在CryBB2全敲小鼠卵巢组织中表达显著下调；预实验还发现Lnc-9163调控 P2rx7 基因表达也下调，而 P2rx7 通过 Ca2+通道发挥作用。据此推测 Lnc-9163可能通过 P2rx7介导 Ca2+通道，进而影响CryBB2对颗粒细胞的增殖、分化和凋亡的作用。本课题拟在前期研究基础上，深入研究 Lnc-9163 在卵巢颗粒细胞发育中的作用以及CryBB2基因上游调控机制，重点探讨 Lnc-9163对卵巢颗粒细胞的增殖以及凋亡影响，以期掌握、并正确运用 Lnc-9163 基因在女性不孕不育中潜在的特殊作用。　　【研究方法】　　1.检测野生型小鼠出生后不同时间阶段卵巢颗粒细胞内Lnc-9163表达水平；　　2.构建卵巢颗粒细胞过表达Lnc-9163体内模型；　　3.构建基于颗粒细胞系KGN的过表达以及干扰Lnc-9163稳定细胞株；　　4.检测Lnc-9163过表达或者干扰后颗粒细胞内CryBB2蛋白表达水平；　　5.探讨颗粒细胞中Lnc-9163对细胞增殖和凋亡功能影响。　　【结果】　　1. 随着小鼠周龄增加，颗粒细胞内Lnc-9163表达量逐渐增加；　　2. 体内通过AAVrh10载体构建卵巢颗粒细胞过表达Lnc-9163模型，qRT-PCR以及WB检测分选出的颗粒细胞内CryBB2含量增加；　　3. 体外通过慢病毒载体构建卵巢颗粒细胞系KGN过表达和干扰Lnc-9163稳定细胞株，qRT-PCR以及WB检测提示Lnc-9163与CryBB2变化趋势一致，即过表达Lnc-9163后CryBB2表达增加，反之亦然；　　4. 通过EdU标记增殖相细胞以及WB检测增殖相关分子结果提示Lnc-9163与颗粒细胞增殖密切相关，过表达Lnc-9163后细胞增殖加快；　　5.TUNEL、Annexin-V/PI、WB凋亡相关蛋白检测结果提示：Lnc-9163过表达促进颗粒细胞内凋亡水平表达，干扰Lnc-9163抑制细胞内凋亡发生。　　【结论】　　我们的研究首次发现 Lnc-9163 在卵巢颗粒细胞发育中逐渐升高，参与调控CryBB2蛋白表达，Lnc-9163促进颗粒细胞增殖，与凋亡发生密切相关。我们的研究为探索CryBB2分子体内调控机制以及女性不孕不育中分子机制提供研究思路。

目录

声明

缩略词表

前言

材料和方法

一、一般常用试剂

二、特殊试剂与试剂盒

三、常用仪器

四、实验方法

（一）小鼠饲养及颗粒细胞分选与培养

（二）过表达Lnc-9163 AAV构建及小鼠尾静脉注射

（三）过表达和干扰Lnc-9163 KGN细胞株构建

（四）蛋白免疫印迹

（五）定量PCR实验

（六）EdU细胞荧光

（七）Annexin V-PI双染细胞凋亡检测

（八）Tunnel法检测细胞凋亡

（九）统计学分析

实验结果

一、随着小鼠周龄增加，Lnc-9163在卵巢颗粒细胞中表达增加

二、Lnc-9163过表达AAVrh10载体构建

三、Lnc-9163过表达后颗粒细胞内CryBB2表达增加

四、颗粒细胞系KGN过表达Lnc-9163及CryBB2 检测

五、颗粒细胞中干扰Lnc-9163下调CryBB2表达

六、Lnc-9163促进颗粒细胞增殖

七、Lnc-9163表达与细胞凋亡密切相关

讨论

参考文献

文献综述:LncRNA对卵巢和卵巢肿瘤功能研究摘要

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢