P22phox通过调控RAS/ERK/HIF--1α通路在胰腺导管腺癌中的作用及机制研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：　　第一部分 P22phox基因敲除小鼠的培育及表型　　目的:P22phox是NADPH氧化酶的重要调节亚基，参与细胞内ROS的生成及细胞代谢的改变。在本实验组前期实验发现PDAC组织中P22phox表达水平明显上调。为探究P22phox在PDAC发生发展中的作用与机制，本实验使P22phox编码基因(CYBA基因)在胰腺腺泡细胞中特异性敲除，构建fElasCreERT;KrasG12D/+;P22phox-/-基因型小鼠，并鉴定小鼠基因型。此外，培育fElasCreERT小鼠和fElasCreERT;p22phox-/-小鼠并鉴定其基因型与表型，探究在胰腺腺泡细胞中特异性敲除P22phox基因后是否会对小鼠胰腺的正常发育产生影响。　　方法:将fElasCreERT小鼠与KrasG12D/+小鼠杂交培育出可诱导的胰腺癌小鼠模型fElasCreERT;KrasG12D/+。再将fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠与P22phox-/小鼠杂交，培育出fElasCreERT;KrasG12D/+;P22phox-/-基因型小鼠。所有小鼠在2-3周龄时剪取小鼠尾巴末端，提取DNA，通过PCR扩增法和凝胶电泳鉴定小鼠基因型。在目前已知的所有研究中，本课题组是第一个将P22phox编码基因在胰腺腺泡细胞中进行敲除。为进一步确定P22phox在腺泡细胞中被完全敲除，提取150天龄fElasCreER小鼠和fElasCreER;P22phox-/-小鼠胰腺腺泡细胞来比较两组小鼠胰腺腺泡细胞中P22phox蛋白表达情况。fElasCreERT小鼠和fElasCreERT;P22phox-/-小鼠在150天龄时处死并提取胰腺组织进行病理学检测，判断各组小鼠胰腺表型。　　结果:通过PCR扩增法和凝胶电泳确认得到目的基因型小鼠。fElasCreER小鼠腺泡细胞中P22phox蛋白高表达而fElasCreER;P22phox-/-小鼠腺泡细胞中无P22phox蛋白表达。150天龄的fElasCreERT小鼠和fElasCreERT;P22phox-/-小鼠胰腺组织均发育良好，无腺泡损伤，炎症及间质纤维化沉积等病理改变。　　结论:成功培育出fElasCreERT;KrasG/12D/+;p22phox-/-基因型小鼠。胰腺腺泡细胞中特异性敲除P22phox编码基因后，小鼠能正常生存，胰腺组织也能够正常发育。这为后续利用fElasCreERT;KrasGl2D/+;P22phox-/-基因型小鼠探讨P22phox在KrasG12D/+驱动的胰腺癌发生发展中发挥的作用奠定基础。　　第二部分 P22phox敲除对KrasG12D突变协同高脂饮食诱导胰腺导管腺癌的影响　　目的:比较正常饮食和高脂饮食处理后KrasG12D/+小鼠的胰腺病理改变情况。探究胰腺腺泡特异性敲除P22phox编码基因对KrasG12D/+协同高脂饮食诱发的胰腺导管腺癌发生发展的影响。　　方法:fElasCreERT; KrasG12D/+小鼠在70天龄时用Tamoxifen诱导后分成两组，一组进行普通饮食饲养，另一组进行高脂饮食饲养。当小鼠达150天龄时处死，取小鼠胰腺组织做H&E染色来评估不同饮食处理的小鼠胰腺组织病理改变情况。取fElasCreERT小鼠、fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠和fElasCreERT; KrasG12D/+; P22phox-/-小鼠，70天龄时用Tamoxifen诱导后给予高脂饮食。一部分小鼠在150天龄时处死取胰腺组织进行病理学检测，评估各组小鼠胰腺病理改变，包括胰腺PanIN病变程度，炎症水平，细胞增殖水平，胰腺星状细胞激活及间质纤维化情况。另一部分小鼠不加干预观察直至死亡，比较各组小鼠的生存时间是否存在差异。　　结果:150天龄普通饮食和高脂饮食处理下的fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠胰腺组织H&E染色结果可见高脂饮食组的fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠胰腺病变情况明显比正常饮食组严重。普通饮食组的fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠胰腺组织仅出现PanIN-1，PanIN-2改变;而高脂饮食组的fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠胰腺中出现高级别PanIN改变，甚至部分进展成胰腺导管腺癌（10只小鼠中3只进展成胰腺导管腺癌）。高脂饮食处理下的fElas CreERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺病变程度较fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠明显减轻。fElasCreERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺组织中Amylase、MIST1的表达较fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠显著升高，而Alcian Blue，MUC5，α-SMA，Ck19，SOX-9，Sirus Red这些胰腺损伤的指标明显表达下降。从细胞增殖水平来说，fElasCreERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺组织中Ki67阳性染色部分较fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠明显减少。从胰腺炎症水平来看，高脂饮食处理的fElasCreERT;KrasG12D/小鼠胰腺组织有明显的CD45和F4/80表达，而在fElasCreERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺组织中CD45和F4/80的表达明显减少。　　结论:单纯的癌基因KRAS突变能引发胰腺损伤但不足以致癌。高脂饮食能有效促进KrasG12D/+的致癌作用。在小鼠胰腺腺泡细胞中特异性敲除P22phox编码基因能在一定程度上抑制KrasG12D/+协同高脂饮食的致癌作用。　　第三部分 P22phox基因敲除抑制KrasG12D突变诱导胰腺导管腺癌的机制研究　　目的:探究胰腺腺泡特异性敲除P22phox能够抑制KrasG12D/+协同高脂饮食的致癌作用的机制。　　方法:提取70天龄时Tamoxifen诱导后进行经高脂饮食处理的150天龄的fElasCreERT小鼠、fElasCreERT;KrasG121D/小鼠和fElasCreERT; KrasG12D/+; P22phox-/小鼠胰腺组织蛋白。利用蛋白免疫印迹法检测各组小鼠胰腺组织中糖酵解关键限速酶HKⅡ和LDHA的蛋白含量。利用Ras Activation Assay Kit检测各组小鼠胰腺组织中具有活性的RAS蛋白(RAS-GTP)含量。利用免疫印迹法检测RAS下游ERK信号通路的激活水平及HIF-1α的表达情况。　　结果:在高脂饮食处理下fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠胰腺中HKⅡ和LDHA的表达较对照组fElasCreERT小鼠明显升高。而fElasCreERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺中HKⅡ和LDHA表达较fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠显著降低。高脂饮食刺激后的fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠胰腺中具有活性的RAS蛋白占总RAS的百分比显著增高，其下游的ERK通路激活水平也明显升高，ERK信号通路调控的HIF-1 α在胰腺中的表达水平也随之增高。相比于fElasCreERT; KrasG12D/+小鼠，fElasCreERT; KrasG12D/+; P22phox-/-小鼠胰腺中具有活性的RAS蛋白占总RAS的百分比，ERK通路激活水平及HIF-1α蛋白的表达均有明显降低。　　结论:高脂饮食处理的fElasCreERT;KrasG12D/+小鼠胰腺中HKⅡ和LDHA水平升高说明小鼠胰腺细胞的代谢方式发生转变，产能途径由正常的氧化磷酸化向糖酵解转换，这一现象符合Warburg效应，也是肿瘤细胞的主要特征。fElasCreERT;KrasG12D/小鼠胰腺细胞代谢方式的变化可通过RAS/ERK/HIF-1 α通路来调节。在胰腺腺泡细胞中特异性敲除P22phox后可通过降低细胞内ROS水平来抑制RAS的激活，阻断RAS/ERK/HIF-1α通路，进而抑制胰腺细胞的代谢网络重构，延缓疾病进展。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分P22phox基因敲除小鼠的培育及表型

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

第二部分P22phox敲除对KrasG12D突变协同高脂饮食诱导胰腺导管腺癌的影响

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

第三部分P22phox基因敲除抑制KrasG12D突变诱导胰腺导管腺癌的机制研究

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

全文总结

综述 胰腺导管腺癌细胞的代谢改变

参考文献

在读期间已发表的论文和参加科研工作情况说明

致谢