肝癌发生发展中糖蛋白糖链合成通路和糖结合蛋白表达定位的研究

摘要

糖基化改变是癌细胞的普遍特征，肿瘤发生时，一方面蛋白质和脂分子糖基化的异常而导致糖蛋白和糖脂中的糖链发生了结构和数量的改变，另一方面和这些糖链相互作用的糖结合蛋白( Glycan-binding proteins，GBPs)的表达也发生变化。开展肿瘤糖蛋白糖链和GBPs的研究对于阐明肿瘤发生和发展的分子机制及其对于肿瘤的诊断和治疗都具有非常重要的意义。国际癌症研究机构的最新资料表明，肝癌是全球最常见的五种恶性肿瘤之一，位居恶性肿瘤死亡率的第二位。我国90%以上的肝癌为肝细胞癌( Hepatocellular carcinoma，HCC)，75%- 80%的HCC发病与肝脏慢性病毒性感染有关，世界范围内80%-90%的HCC患者伴随有肝纤维化。虽然，目前研究表明：在肝病的炎症、纤维化、癌变的过程中均有糖蛋白糖链结构和功能的改变，但是糖蛋白糖链合成通路及与其相互作用的GBPs的表达是如何发生变化则了解不多。　　本论文首先运用凝集素芯片对肝癌发生发展中膜糖蛋白糖链谱进行研究，并用凝集素组化确定差异性表达的糖链在细胞中的分布、定位情况。在肝纤维化模型中，14种凝集素(如Jacalin、MAL-Ⅱ和AAL)和3种凝集素(SJA、EEL和ConA)识别的糖链结构分别在激活态LX-2细胞膜糖蛋白中表达上调和下调。在肝癌模型中，肝癌细胞系HepG2膜糖蛋白中12种凝集素(如Jacalin、MAL-Ⅱ、LTL和LEL)的表达信号增强，6种凝集素(如WFA、PTL-Ⅰ、WGA和UEA-Ⅰ)表达信号降低；肝癌细胞系SMMC-7721膜糖蛋白中11种凝集素(如Jacalin、MAL-Ⅱ、SJA和LTL)表达信号增强，13种凝集素(如ECA、WFA、GSL-Ⅱ和PTL-Ⅰ)表达信号降低，同时，10种凝集素(如ECA、GSL-Ⅱ、PTL-Ⅰ和LEL)在两种肝癌细胞系膜糖蛋白中差异表达，其中8种凝集素(如ECA、GSL-Ⅱ、PTL-Ⅰ和LEL)识别的糖链结构在HepG2膜糖蛋白中较SMMC-7721中显著性高表达，2种凝集素(Jacalin和VVA)识别的糖链结构在HepG2膜糖蛋白中较SMMC-7721中显著性低表达。凝集素组化结果显示差异性表达的糖链主要分布在细胞的细胞膜，核周胞质区（内质网和高尔基体）上，这些数据为寻找膜糖蛋白糖基化与肝纤维化发生的关联性及肝癌的早期诊断、抗肿瘤药物的研发提供有用信息。　　利用糖基因芯片对肝癌发生发展中细胞内糖相关基因转录水平进行研究，然后用实时荧光定量PCR和Western blot对差异性表达的糖相关基因和蛋白进行验证。在肝纤维化模型中，39种糖相关基因在激活态LX-2细胞中转录水平显著高表达，36种糖相关基因在激活态LX-2细胞中转录水平显著低表达。在肝纤维化发生过程中，共有75种探针对应的转录水平发生改变，约占总探针数的18.66%。在190种糖酶基因探针中，42种探针对应的转录水平发生改变，约占糖酶基因探针总数22.11%。在肝癌模型中，分别有29种和37种糖相关基因在肝癌细胞系HepG2中转录本的RNA水平上调和下调；分别有19种和14种糖相关基因在肝癌细胞系SMMC-7721中转录水平显著性高表达和低表达，有272±93种探针显示有效结合信号，约占探针67.66%，在190种糖酶基因探针种，有114±21种探针显示有效结合信号，约占糖酶基金探针的60.00%。通过比较发现，糖酶基因变化的比例较其他基因变化的比例要高，此结果说明，在肝癌发生发展中与糖链合成调控相关的基因在转录水平明显改变，说明蛋白糖基化的变化是肝癌发生发展中的一项重要的生理变化。肝癌发生发展中，糖相关基因主要参与了N-/O-糖链合成、硫酸角质素合成、硫酸软骨素合成、硫酸乙酰肝素合成及糖胺聚糖降解通路等，在上调的糖相关基因代谢通路中，以N-糖链合成通路为例加以说明基因的改变。在此通路中主要涉及ALG2、ALG8、ALGIO、CST、MGAT3、MGAT4及MGAT5等糖相关基因的改变，这些基因主要与N-糖链前体的合成有关，如ALG2与Dol-P-Glc糖链合成有关；MGAT3与P-Man糖链合成有关，其在通路中起正调节作用，而其他基因起辅助调控作用。下调基因参与的代谢通路，以糖胺聚糖降解通路为例，在此通路中，主要涉及HYAL、IDUA、NAGLU、GUSB等糖相关基因，这些基因主要与抑制糖链合成或与糖链的降解有关，起负调控作用。　　使用糖芯片对肝癌发生发展中差异性表达的GBPs进行研究。在肝纤维化模型中，12种糖探针(如Gal、GaINAc和Man-9Glycan)识别的GBPs在激活态LX-2细胞中表达水平显著增加，7种糖探针(如NeuAc、Lac和GlcNAc-O-Ser)识别的GBPs在激活态LX-2中表达水平显著降低。在肝癌模型中，8种糖探针（如SL、LNT和GaINAc）识别的GBPs在肝癌细胞系HepG2中显著性高表达；5种糖探针(如Man、Man-9-Glycan和Xyl)识别的GBPs在肝癌细胞系HepG2中显著低表达。糖细胞化学结果显示，GBPs主要分布在细胞的细胞膜、中央胞质区及核周胞质区。通过对肝癌发生发展中GBPs的研究，希望能够准确了解肝癌发生发展中GBPs的变化，为揭示GBPs与肝癌发生发展的关系提供理论依据，并为寻找肝癌相关肿瘤潜在标志物的研究提供新思路。　　利用质谱技术对肝纤维化发生中差异性表达的GBPs进行质谱鉴定，半乳糖胺糖结合蛋白(GaINAc-binding proteins，GNBPs)鉴定结果如下：分别从激活态和静息态LX-2细胞中鉴定到264种和257种GN BPs，通过峰面积定量，分别有46种和40种GNBPs在激活态LX-2细胞中差异性高表达和低表达。木糖糖结合蛋白(Xyl-bindingproteins，XBPs)鉴定结果如下：分别从激活态和静息态LX-2细胞中鉴定到70种和64种XBPs，通过峰面积定量对鉴定到的XBPs进行分析，有30种XBPs在激活态LX-2显著高表达，有14种XBPs在激活态LX-2中显著低表达。这些差异性表达的蛋白主要参与蛋白结合功能和催化功能等。通过Western blot和血清芯片对鉴定到的GBPs（如PDIA6和APOA1）进一步研究，结果显示PDIA6和APOA1的ROC曲线的线下面积(Area Under Curves，AUCs)均大于0.8，PDIA6的AUCs为0.8985( 0.8132-0.9838, p＜0.0001), APOA1的AUCs为0.8738( 0.7830-09646,-p＜0.0001),说明PDIA6和APOA1作为肿瘤潜在标志物的诊断具有一定的准确性，亦有95%的几率将肝纤维化／肝硬化患者与健康人通过血清诊断的方式区分开来，说明GBPs可用作为肿瘤潜在标志物并用于后续研究。　　最后对罹患系列肝病（HBV引起的乙肝、肝硬化和肝癌）患者唾液中糖蛋白SAα2-3/6糖链结构与易感流感病毒关系进行研究，用8株禽流感病毒毒株(H5、H7和H9亚型)及HINI灭活病毒疫苗（拟人流感病毒）与肝病患者及健康人唾液进行印记实验，结果发现，肝病患者唾液中糖蛋白SAα2-3糖链结构的丰度较同年龄同性别的健康人唾液中的显著降低，提示肝病患者易感染禽流感；而肝病患者唾液中糖蛋白SAα2-6糖链结构的丰度较同年龄同性别的健康人唾液中的略高或没有显著差别，提示肝病患者具有较强或正常的抵抗人流感病毒的能力。本研究又对其他慢性病(如二型糖尿病(T2DM)、胃癌）患者与易感流感病毒的关系进行研究，结果发现，T2DM患者属于流感病毒易感人群，而胃癌患者唾液中的SAα2-3和α2-6糖链结构丰度与同年龄同性别的健康人唾液中的差别不大，提示胃癌患者具有正常的禽流感病毒和人流感病毒的抵抗能力，本研究建立了一款用于筛查禽流感和人流感病毒易感人群的凝集素芯片，通过唾液快速简便检测筛查流感病毒易感人群，为防控禽流感及治疗提供了新方法。

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