Sp1锌指蛋白与铂类抗肿瘤药物的相互作用研究

摘要

尽管DNA被普遍认为是铂类抗肿瘤药物的作用靶点，然而越来越多的研究结果表明，蛋白质可能通过改变铂类药物的细胞摄取，胞内传递路径以及铂损伤DNA修复等方式影响着肿瘤细胞对铂类抗肿瘤药物的敏感性。蛋白质组学研究结果表明，肿瘤细胞在铂类抗肿瘤药物的培养下，细胞内一系列蛋白质的表达水平发生了变化，表明铂类药物很可能通过影响基因的转录调控过程而影响肿瘤细胞内相关蛋白质的表达水平，进而调节肿瘤细胞对顺铂药物的敏感性。这一实验现象也预示着铂类抗肿瘤药物与转录因子之间存在着潜在作用，即铂类抗肿瘤药物通过直接或间接影响细胞内一系列转录因子的功能，进而引发其下游基因转录表达过程的改变。由于锌指蛋白家族作为细胞内最大的转录因子成员以及锌指在结构上的特殊性，使得锌指蛋白很可能是铂类抗肿瘤药物的潜在作用靶点。
　　 本论文围绕Sp1锌指蛋白与不同铂配合物相互作用的研究，以及这种作用对Sp1锌指蛋白结构和功能的影响。研究内容涉及以下几个方面:(1)比较了不同铂化合物与Sp1锌指蛋白反应活性的差异，研究构型和配体对铂化合物与Sp1锌指蛋白反应活性的影响;(2)我们在发现配体具有调控铂化合物与Sp1锌指蛋白反应活性这一现象的基础上，进一步讨论了噻唑配体(Thiazole/Tz)调节铂化合物对Sp1反应活性的可能分子机制;(3)我们研究反应体系微环境对顺铂与Sp1锌指蛋白反应过程的影响，系统研究了还原剂Tris-(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)小分子促进顺铂与Sp1锌指蛋白反应的分子机理。
　　 第一章主要是对锌指蛋白以及铂类抗肿瘤药物作用机理的综述，内容主要涉及锌指蛋白在细胞内分布的广泛性和功能的重要性，铂类抗肿瘤药物的结构活性关系，蛋白在铂类抗肿瘤药物中的重要性，以及锌指蛋白可能是铂类抗肿瘤药物在生物体内的潜在作用靶点。
　　 第二章是Sp1锌指蛋白与不同铂化合物相互作用的研究。通过对Sp1锌指蛋白与不同铂化合物相互作用的研究，我们发现反式铂噻唑化合物（trans-PtTz）对Sp1锌指蛋白具有很强的反应活性，而其它铂化合物对Sp1锌指蛋白的反应活性较弱。CD光谱和核磁共振实验表明，反式铂噻唑化合物可以有效破坏Sp1蛋白的锌指结构。由于Sp1锌指结构是Sp1转录因子结合DNA并执行基因转录调控的前提，我们进一步研究发现，反式铂噻唑化合物通过破坏Sp1蛋白的锌指结构而抑制了Sp1转录因子与DNA的结合。此外，我们在细胞水平上证明了反式铂噻唑化合物与Sp1转录因子之间相互作用的可能性，由于Sp1转录因子锌指结构的完整性是 Sp1蛋白从细胞质到细胞核穿梭过程所依赖的，我们在细胞水平上证实了反式铂噻唑化合物通过破坏Sp1转录因子的锌指结构而抑制了Sp1蛋白从细胞质到细胞核的穿梭过程。这些发现表明铂化合物可能通过干扰细胞内转录因子的功能而影响其下游基因的表达，这个过程可能与反式铂噻唑化合物的抗癌机理相关。
　　 第三章我们进一步讨论了配体对铂化合物与Sp1锌指蛋白反应活性的影响。我们在研究不同配体的铂化合物与Sp1锌指蛋白反应活性差异的过程中发现，反式铂噻唑化合物与Sp1锌指蛋白具有很强的反应活性，而含其它配体的铂化合物对Sp1锌指蛋白的反应活性较弱。这实验现象充分表明配体可能在很大程度上调控铂化合物对蛋白的反应活性。首先，我们考查了配体在π堆叠效应对铂化合物与Sp1锌指蛋白反应活性的影响，发现噻唑配体与吡啶配体对Sp1锌指蛋白的π堆叠作用上具有类似的效应。这说明反式铂噻唑化合物对Sp1锌指蛋白的高反应活性并不是由噻唑配体对Sp1锌指蛋白的π堆叠效应所导致。我们进一步考察了芳香配体上游离的原子对铂化合物与Sp1锌指蛋白反应活性的影响。实验结果表明，芳香配体上游离原子的存在确实能很大程度上促进铂化合物与Sp1锌指蛋白之间的反应。这些发现一方面解释了反式铂噻唑化合物对Sp1锌指蛋白具有高的反应活性的原因，另一方面为通过改变铂化合物的配体来设计一些对某些肿瘤蛋白具有较高选择性的铂化合物提供了思路。
　　 第四章我们研究了反应体系微环境对顺铂(cisplatin)与Sp1锌指蛋白反应的影响。已有一些文献报道，顺铂可有效破坏锌指蛋白的锌指结构域，并导致其锌指结构域内Zn2+的逐出和锌指结构的丧失。然而我们在实验过程中发现，顺铂对Sp1锌指蛋白的反应活性很弱。我们对比已有报道文献的反应过程与自己的实验过程，并通过实验证明了反应体系中添加Tris-(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP)还原剂可以在很大程度上促进了顺铂与Sp1锌指蛋白之间的作用。我们对反应机理进一步研究发现，TCEP还原剂通过磷原子取代顺铂上的Cl-，极大活化顺铂反位上NH3并导致NH3的解离，进而促进了顺铂与Sp1锌指蛋白之间的反应。这些发现说明TCEP通过磷原子的反位效应极大程度上促进了顺铂与Sp1锌指蛋白之间的反应，该结果也预示者生物体内可能存在某些生物小分子影响顺铂与蛋白之间的相互作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 锌指蛋白简介

1．1．1 锌指蛋白

1．1．2 锌指蛋白的分类

1．1．3 锌指蛋白与DNA相互作用

1．1．4 锌指蛋白与RNA的识别作用

1．1．5 锌指蛋白与蛋白相互作用

1．2 Sp1锌指蛋白

1．2．1 Sp1蛋白

1．2．2 Sp1锌指蛋白在肿瘤发生中的作用

1．2．3 Sp1锌指蛋白在肿瘤转移过程中的作用

1．3 铂类抗肿瘤药物

1．3．1 顺铂的作用机理

1．3．2 非经典铂化合物

1．3．3 蛋白质在顺铂作用机理中的作用

1．4 锌指蛋白作为铂类抗肿瘤药物的潜在靶点

参考文献

第二章 Sp1锌指蛋白与不同铂化合物相互作用的研究

2．1 引言

2．1．1 抗肿瘤药物顺铂与非药物活性反铂

2．1．2 非经典铂类化合物

2．1．3 蛋白在铂类抗肿瘤药物中的作用

2．1．4 Sp1锌指蛋白在铂类抗肿瘤药物中的作用

2．1．5 本课题的提出和待解决的问题

2．2 实验材料与方法

2．3 结果与讨论

2．4 结论

参考文献

第三章 配体对铂化合物与Sp1锌指蛋白反应活性的影响

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．3 结果与讨论

3．4 结论

参考文献

第四章 反应体系对顺铂与Sp1锌指蛋白反应活性的影响

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．3 结果与讨论

4．4 结论

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果