狂犬病毒基因位点突变与细胞适应相关性研究

摘要

狂犬病是一种100％致死的严重危害公众健康和生命安全的人畜共患病。狂犬病毒（Rabies virus，RABV）属于弹状病毒科弹状病毒属，是一种不分节段的单股负链RNA病毒，其基因组大小约为12kb，可编码核蛋白、磷酸蛋白、基质蛋白、糖蛋白及大转录蛋白这5个结构蛋白。狂犬病通过患病的蝙蝠、狗、老鼠和臭鼬等哺乳动物抓伤咬伤人类的途径进行传播。与其它传染病不同的是，狂犬病可通过暴露前和暴露后的疫苗免疫接种途径进行预防。据统计，每年约有59000人死于狂犬病，其中95％的患者来自亚洲、非洲等发展中国家。造成这一严重状况的主要原因，是较高的疫苗成本和患病动物难以控制等所致。近几十年来，现代细胞培养技术使得疫苗纯度、效率、安全、产量和经济成本得以改善，所以通过寻找病毒的关键基因功能位点，来提高狂犬病疫苗的细胞适应性和稳定性，是未来狂犬病疫苗研究亟待解决的核心问题。　　本研究从7头患病牛中分离获得两株狂犬病毒，分别命名为CNIM1701和CNIM1702，并对其进行全基因组测序，提交NCBI，基因编号为KY649620和MF172976。通过进化树分析表明，本试验所用的两株毒株与蒙古毒株和俄罗斯毒株的亲缘关系更近。将CNIM1701在鼠脑中进行传代，当病毒传至第八代（CNIM1701-8）时，小鼠死亡时间稳定下来，显示CNIM1701-8对mNA和BSR细胞出现细胞适应性。对CNIM1701-8进行全基因组测序表明，CNIM1701-8在G和L蛋白中出现突变，如G蛋白S170A、P367S，L蛋白E1620D，并且证明这些突变是逐代增多的。将狂犬病毒组织毒和细胞毒进行进化树分析和特殊位点比对，结果表明G367突变的氨基酸与Flury株的氨基酸一致，并且发现G83可能也是区分细胞适应性的关键位点。通过反向遗传学对SAD毒株G83和G367位点进行突变与拯救病毒，表明G83和G367位点影响病毒细胞的适应性。　　综上所述，G83和G367是影响细胞适应性的关键位点，可进一步提高狂犬病毒细胞疫苗的生产效率。

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摘 要

缩略词表

Abbreviations

1 狂犬病毒的结构

2狂犬疫苗的种类

3 狂犬疫苗的研制方法

4 结语

参考文献

第二章 试验研究

狂犬病毒基因位点突变与细胞适应性的相关性研究

前 言

1 材料与方法

1.1 材料

2 结果与分析

2.1 病料的采集及处理

2.2 狂犬病毒的分离与鉴定

2.3 狂犬病毒基因的扩增与测序

2.4 狂犬病毒的同源性分析

2.5 狂犬病毒在动物和细胞中的传代与适应

2.5.1 狂犬病毒在乳鼠中的传代

2.6 狂犬病毒弱化后的同源性分析

2.7 狂犬病毒弱化后基因突变的检测

2.8 R83K和P367S重组病毒的拯救

3 讨论

3.1 利用组织适应毒研究狂犬病毒的细胞适应性

3.2 CNIM1701和CNIM1702的同源性分析

3.3 狂犬病毒细胞适应性与致病力的相关性

5 结论

参考文献

致 谢