不同耐药表型鲍曼不动杆菌毒力及蛋白质组学差异性研究

摘要

目的：　　以内蒙古地区住院病人分离鲍曼不动杆菌为研究对象，分析鲍曼不动杆菌不同耐药表型分离株体外粘附和侵袭能力是否存在差异，进一步对3株不同耐药表型分离株蛋白质组学差异性进行研究，探究鲍曼不动杆菌耐药性增加与其毒力变化之间是否存在相关性及其可能机制，为进一步阐明鲍曼不动杆菌致病机制及指导鲍曼不动杆菌感染防控和治疗提供新的实验数据。　　方法：　　1.菌株收集：随机收集内蒙古地区住院病人2011年11月—2013年11月间各类临床标本中分离50株鲍曼不动杆菌作为研究对象。　　2.体外药敏试验：除多粘菌素外，其它抗菌药物均采用K-B纸片扩散法进行检测，多粘菌素采用微量肉汤稀释法进行检测。　　3.分子分型：分别采用脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)方法和多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术对50株鲍曼不动杆菌进行基因分型，分析其基因型特征。　　4.体外粘附实验：筛选不同基因型及耐药性菌株为研究对象。纤维粘连蛋白（fibronectin,Fn,10μg/ml）包被96孔细胞培养板后，各孔中滴加不同鲍曼不动杆菌菌悬液进行孵育，采用分光光度计检测每一实验孔的吸光值（OD值），以OD值大小表示粘附细菌的数量及密度，用以反映不同株的粘附能力。　　5.体外侵袭实验：筛选不同基因型及耐药性菌株为研究对象，采用抗生素保护实验方法进行实验。A549肺腺癌细胞株与鲍曼不动杆菌菌悬液按照1:100比例进行孵育，用多粘菌素清除未侵入细胞内细菌及游离细菌。处理后细胞经Triton-100裂解后等量接种麦康凯培养基进行培养，人工计数各平板细菌菌落数，以细菌菌落数的多少来反映每株鲍曼不动杆菌侵袭能力的强弱。　　6.蛋白质组学分析：选取耐药特征不同的3株菌作为研究对象，采用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)与串联质谱技术，对三株菌菌体蛋白所得蛋白质多肽质谱图进行分析，经Mascot数据库检索，分析不同耐药株蛋白质组学特征。　　结果：　　1.体外药敏试验：仅A9株对哌拉西林耐药而对其它所有测试药物敏感，其余菌株耐药表型差异明显，都为多重耐药株和泛耐药株。　　2.分子分型：50株鲍曼不动杆菌共划分为22个PFGE基因型，共29个亚型；其中，A和E型为优势型，分别占22％（11/50）和24%（12/50）；MLST分型结果显示，50株菌共分4个基因型，优势型为ST208型，占56.00%(28/50)，其次为ST368（10%，5/50）、ST373(8%,4/50）、ST191(4%,2/50)。其它11株菌部分基因测序结果不能与已公布序列匹配，可能是新的基因型。　　3.体外粘附实验结果：体外粘附能力最强的菌株归属于PFGE型J型，该菌株对除头孢他啶，头孢吡肟和哌拉西林外都敏感；粘附能力最弱的菌株为PFGE型D型，仅对亚胺培南和多粘菌素敏感。多重耐药株、泛耐药株分别与标准菌株ATCC19606和A9株相比，OD值差异均无统计学意义（p>0.05）。4.体外侵袭实验结果：体外侵袭能力最强的菌株属于PFGE型P型，该株菌仅对哌拉西林耐药而对其它所有测试药物敏感。侵袭能力最弱的菌株为PFGE型D型，仅对亚胺培南和多粘菌素敏感。多重耐药株和泛耐药株分别与ATCC19606株进行比较，细菌菌落数无统计学意义（U=32.5，p>0.05；U=18，p>0.05）；多重耐药株和泛耐药株分别与A9株相比，细菌菌落数明显减少（U=4，p<0.05；U=5.5，p<0.05）；多重耐药株和泛耐药株比较，细菌菌落数无统计学意义（U=139.5，p>0.05）。　　5.蛋白质组学分析结果：A9株、多重耐药株（A8株）和泛耐药株（A1株）相比，49个差异蛋白的表达量呈逐步降低趋势。从功能上划分，这49个差异蛋白分可为三类：第一类：代谢相关酶或蛋白（27个）；第二类：基因转录相关蛋白（3个）；第三类：未鉴定及功能未知蛋白质（共19个）。22个差异蛋白的表达量呈逐步升高趋势。从功能上划分，这22个差异蛋白分可为两类：第一类：代谢相关酶或蛋白（13个）；第二类：未鉴定及功能未知蛋白质（共9个）。　　结论：　　1.内蒙古地区鲍曼不动杆菌临床分离株基因型呈多样化特征，不同基因型菌株耐药谱差异明显。　　2.耐药表型不同的鲍曼不动杆菌，其体外粘附能力未见明显差异。但耐药性强的菌株，其体外侵袭力呈逐渐降低趋势，耐药性的增加可能与其侵袭力大小呈负相关。　　3.耐药性强的鲍曼不动杆菌，多种差异蛋白表达量表现降低或升高，这一结果提示：鲍曼不动杆菌耐药性的增加可能伴随特定蛋白表达量的降低或增高，但这些蛋白在鲍曼不动杆菌致病过程中的具体作用有待进一步研究。

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英文摘要

前言

材料和方法

1.实验材料

2.实验方法

结果

一、体外药敏试验结果

二、PFGE分型结果

三、MLST结果

四、体外粘附实验结果

五、体外侵袭实验结果

六、蛋白质组学分析结果

讨论

结论

参考文献

文 献 综 述:鲍曼不动杆菌耐药性及毒力特征研究进展

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