淫羊藿次苷Ⅱ促进骨髓间充质干细胞成骨分化及相关基因表达的研究

摘要

目的：　　观察不同浓度ICSⅡ对rBMSCs成骨分化和成骨活性的影响，筛选出ICSⅡ促进rBMSCs成骨分化最佳浓度级别，并初步探讨其分子学机制，为ICSⅡ结合组织工程学治疗ONFH提供理论基础。　　方法：　　1.选取6只SPF级SD大鼠幼鼠，脱颈处死，全骨髓贴壁法分离、提取rBMSCs，光镜下观察细胞形态和生长状态。取原代细胞，应用成骨诱导分化培养基、成软骨诱导分化培养基、成脂诱导分化培养基进行诱导，鉴定rBMSCs的多向分化能力。　　2.rBMSCs传代培养至第三代，将细胞接种于12孔或96孔细胞培养板。设立低、中、高剂量三个实验组，分别选用ICSⅡ浓度为1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的培养基进行培养，对照组为含有与实验组相同浓度的DMSO溶液。待细胞融合度达60%-70%时加入成骨诱导液进行成骨性诱导，2周后茜素红染色观察比较各组钙化结节形成量；成骨性诱导的第3、6、9、12天四个时间点进行ALP活性检测，测定细胞成骨活性；在诱导0h、4h、12h、24h、48h、96h检测成骨相关基因Osterix（OSX）、Runx-2表达量。根据染色及检测结果分析在rBMSCs成骨分化过程中ICSⅡ发挥作用的最佳浓度级别，并初步探讨其分子学机制。　　结果：　　1.本实验所提取分离的rBMSCs在培养的各个阶段与骨细胞图谱中所描述的形态学特征均吻合。在多向分化诱导方面，细胞形态逐渐改变，符合成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞的形态特征，染色结果显示不同分化方向的细胞分别出现钙盐沉积、蛋白聚糖、油滴等的生理学特性，证明该细胞具有较强的多向分化能力。　　2.不同浓度ICSⅡ对rBMSCs成骨分化的影响：（1）茜素红染色结果：实验组的钙化结节数量均明显高于对照组；实验组组间比较显示：中剂量组钙化结节数量明显高于低剂量组和高剂量组，低剂量组和高剂量组钙化结节数量未见明显不同。（2）ALP检测结果显示：在第3、6、9、12天，实验组ALP活性均高于对照组，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；中剂量组ALP活性均高于低剂量组和高剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组与高剂量组之间相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）成骨相关基因OSX表达检测：在不同时间点检测中，低、中、高三个实验组的基因表达均高于对照组，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；中剂量组在不同时间点基因表达高于低剂量组和高剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组与高剂量组比较，在第12h时检测结果差异有统计学意义（P=0.044），其余时间点差异无统计学意义（P＞0.05）。（4）Runx-2表达量检测：在不同时间点检测中，低、中、高三个实验组的基因表达均高于对照组，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；中剂量组在不同时间点表达均高于和低剂量组、高剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组和高剂量组比较，在第48h时差异有统计学意义（P=0.045），其余时间点差异无统计学意义（P＞0.05）。　　结论：　　1.ICSⅡ可以显著促进rBMSCs成骨分化，且促进作用与浓度有一定关系。　　2.通过细胞染色、ALP活性测定，初步确定10μg/mL的浓度的ICSⅡ可获得良好的成骨分化和成骨活性效果。　　3.成骨相关基因OSX、Runx-2的表达与细胞染色、ALP检测趋向一致，证实前面所述结果，并且提示ICSⅡ是通过增强OSX，Runx-2的表达发挥其促进rBMSCs成骨性分化作用。　　4.ICSⅡ可通过组织工程技术直接用于ONFH的靶点治疗，并且有望将浓度确定至精确值，最大化发挥其促进成骨分化和成骨活性作用。

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