龟羚帕安丸对PD大鼠NSCs移植后中脑黑质TH、GDNF及Ptx3表达的影响

摘要

目的:　　以神经干细胞（Neural stem cells, NSCs）为供体细胞的细胞替代疗法是目前研究帕金森病（Parkinson's disease, PD）的热点，也被认为是潜力最大、临床应用前景最好的PD治疗策略，随着研究的深入发现：移植的NSCs存活率极低，严重影响PD的长期疗效。中药在PD治疗中有其独特的优势，本实验以6-羟基多巴胺（6-hydroxy dopamine,6-OHDA）建立的PD大鼠模型为研究对象，观察龟羚帕安丸对PD大鼠NSCs移植后中脑黑质TH、GDNF及Ptx3表达的影响，探索龟羚帕安丸对移植入PD大鼠脑内的NSCs影响的可能作用机制，为临床提高PD神经干细胞移植的长期疗效寻找新的方法。　　方法：　　选择性成熟雌雄SD大鼠，按2:1合笼制备Ed16孕鼠，分离出胎鼠的海马细胞，机械吹打法制备单细胞悬液，接种于神经干细胞培养液（DMEM/F12、B27、EGF、bFGF、双抗）中进行培养、传代，并用免疫荧光法进行NSCs的Nestin鉴定。用神经干细胞分化液（DMEM/F12、胎牛血清、B27、EGF、bFGF、双抗）诱导NSCs贴壁分化。将鉴定完成的NSCs用BrdU进行标记、鉴定。　　将6-羟基多巴胺（6-hydroxy dopamine,6-OHDA）利用脑立体定位法注射到SD大鼠中脑黑质致密部以建立PD大鼠模型，1周后用盐酸阿朴吗啡（APO）腹腔注射进行行为学检测。按随机数字表法将成功的PD大鼠分为6组：中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、美多芭组、NSCs移植对照组、空白对照组。将BrdU标记过的NSCs单细胞悬液利用脑立体定位法注射到大鼠纹状体；按照分组情况进行灌胃，常规饲养。分别在细胞移植前（0周）及移植后4周时对各组PD大鼠进行行为学检测；灌胃30天取材，免疫组化法检测大鼠纹状体BrdU、中脑黑质致密部TH、GDNF、Ptx3蛋白表达；原位杂交法检测中脑黑质致密部THmRNA的表达；HE染色观察。统计方法：组间比较采用SNK检验；指标间进行Pearson相关性分析。　　结果：　　1.培养的原代细胞多呈球形，大小不一，折光性较强；24小时后细胞开始聚团，数个至数十个细胞不等，边缘模糊；培养7天后神经球多为数百个细胞聚集而成，细胞排列紧凑，边缘规则。　　2.传代细胞培养24小时后即出现数十个细胞聚成的细胞球，与原代细胞相比，细胞球形成的速度更快，细胞球更为规则。　　3. Nestin免疫荧光结果显示，原代细胞和传代细胞几乎全部呈Nestin阳性表达，呈绿色荧光，亦可见散在的Nestin阳性细胞；而F4代细胞Nestin阳性表达有所减弱。　　4.在SD大鼠中脑黑质致密部单点注射6-OHDA24μg，APO诱导后模型组造模成功率为71%。　　5.大鼠旋转圈数差值比（K）进行SNK检验显示，龟羚帕安丸高、中、低剂量组（K）比值更高（P<0.01），说明龟羚帕安丸中药组改善PD大鼠症状更为明显。　　6.龟羚帕安丸高、中、低剂量组大鼠纹状体 BrdU阳性表达高于其他各组（P<0.01），即各中药组大鼠纹状体存活的NSCs更多，表明龟羚帕安丸具有促进外源性NSCs存活的作用。　　7.龟羚帕安丸高、中、低剂量组大鼠中脑黑质致密部TH及THmRNA含量均高于NSCs移植对照组（P<0.01），即各中药组大鼠中脑黑质致密部DA能神经元数量多于NSCs移植对照组，说明龟羚帕安丸具有促进外源性NSCs向DA能神经元分化的作用。　　8.龟羚帕安丸高、中、低剂量组大鼠中脑黑质致密部GDNF、Ptx3含量均显著高于NSCs移植对照组（P<0.01），说明龟羚帕安丸能提高GDNF、Ptx3的表达水平，进而间接抑制DA能神经元凋亡而促进其存活。　　9.分别对TH与GDNF、TH与Ptx3进行Pearson分析，结果显示TH与GDNF呈显著正相关(r=0.879, P=0.000)；TH与Ptx3呈显著正相关(r=0.943, P=0.000)。　　结论：　　利用Ed16大鼠胚胎的海马组织能够分离出NSCs，并成功完成NSCs的培养、传代及Nestin鉴定，将其定位移植到大鼠纹状体后，龟羚帕安丸联合神经干细胞能有效改善PD大鼠的症状，且中药中剂量组改善更为明显。龟羚帕安丸一方面可以促进外源性神经干细胞的存活，直接促进其向DA能神经元分化；另一方面促进PD大鼠脑内GDNF及Ptx3的表达，间接抑制DA能神经元凋亡而促进其存活。

目录

声明

缩略词

前言

实验一SD大鼠神经干细胞的培养与鉴定

材料与方法

1实验材料

2实验方法

结果

1原代细胞培养观察

2传代细胞培养观察

3神经干细胞Nestin鉴定

4神经干细胞分化的细胞形态学观察

5神经干细胞的BrdU标记检测

讨论

1神经干细胞分离与培养

2神经干细胞Nestin鉴定

实验二龟羚帕安丸对PD大鼠NSCs移植后中脑黑质TH、GDNF及Ptx3表达的影响

材料与方法

1实验材料

2实验方法

结果

1帕金森病大鼠模型建立

2对各组大鼠行为学影响

3对各组大鼠纹状体BrdU标记的NSCs影响

4对各组大鼠中脑黑质TH蛋白及mRNA表达影响

5对各组大鼠中脑黑质GDNF及Ptx3蛋白表达影响

6 TH与GDNF、Ptx3相关性分析

7中脑黑质致密部HE染色观察

讨论

1帕金森病大鼠模型建立

2中医对帕金森病认识

3龟羚帕安丸诱导移植NSCs分化为多DA能神经元机制分析

4龟羚帕安丸对PD模型神经干细胞诱导分化作用机制

结论

参考文献

致谢

附录1-图 片

附录2-综 述:帕金森病神经干细胞移植实验研究进展

附录3-研究生期间发表论文及参与科研情况