清热化痰散结方及其拆方抑制人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69 PI3K-Akt-mTOR信号转导的研究

摘要

目的：　　通过观察清热化痰散结方及其清热、化痰、散结3个拆方对人肺鳞癌SK-MES细胞和小细胞肺癌 NCI-H69细胞的增殖抑制和 PI3K-Akt-mTOR信号转导通路蛋白表达的影响，研究清热化痰散结方治疗肺癌这两种细胞的机理，寻求有效的中医方药，从分子层面初步探讨中医中药对肺癌治疗的作用机制。　　方法:　　运用 MTT法分别检测533味中药对人肺癌细胞 SK-MES和 NCI-H69增殖抑制的作用，筛选出均能抑制两种细胞增殖的药物，根据《中药学》药物功效、正交试验设计结果和导师经验优选出最佳方剂；用倒置显微镜观察各方对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69细胞形态的影响；运用流式细胞术检测各方对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69细胞周期的影响；运用Western blot法分析各方对人肺癌细胞 SK-MES和 NCI-H69 PI3K-Akt-mTOR信号转导通路中 PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响。　　结果：　　①筛选出5味对人肺癌细胞 SK-MES和 NCI-H69增殖均有抑制作用的药物。②优选出最佳方剂清热化痰散结方。③清热化痰散结方及其拆方均能抑制人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69的增殖，细胞形态与正常组相比均有所改变。肺鳞癌SK-MES细胞：各方均漂有死细胞；清热方的细胞间接触松散，细胞皱缩；化痰方的细胞形态变小，细胞间隙变大；散结方的细胞较对照组偏小，部分细胞膜皱缩发泡且细胞透光度增高；全方的细胞间隙变大，细胞皱缩；小细胞肺癌NCI-H69细胞：清热、化痰、散结和全方对NCI-H69细胞均有抑制作用，细胞数量减少，细胞聚团生长变少，单个细胞存在现象较为普遍，死细胞较多，其中散结方的细胞偏小。④清热化痰散结方及其拆方均能抑制人肺癌细胞 SK-MES和NCI-H69的增殖，以全方作用最强，呈剂量依赖和时间依赖关系，对SK-MES细胞增殖抑制作用强弱依次为：全方﹥散结方﹥清热方﹥化痰方，对NCI-H69细胞增殖抑制作用强弱依次为：全方﹥清热方﹥散结方﹥化痰方。⑤清热化痰散结方及其拆方对人肺癌细胞 SK-MES和 NCI-H69的细胞周期都有明显影响。SK-MES和NCI-H69细胞：清热化痰散结方及其拆方S期细胞比率明显增加，SK-MES细胞作用强弱依次为化痰方>清热方>全方>散结方，散结方不仅可以作用于 S期，还可以作用于 G2期；NCI-H69细胞：作用强弱依次为化痰方>清热方>散结方>全方，全方不仅可以作用于 S期，还可以作用于 G2期。⑥通过文献查阅得知人肺鳞癌SK-MES和小细胞肺癌NCI-H69中均有PI3K、Akt、mTOR蛋白表达，当其各自使用清热方、化痰方、散结方及全方 IC50值的药物浓度作用时，发现各方对 PI3K、Akt、mTOR蛋白均有不同程度的抑制作用，两种细胞 mTOR和 PI3K蛋白表达均显示各方效果强弱依次为：全方﹥散结方﹥清热方﹥化痰方；两种细胞 Akt蛋白表达均显示各方效果强弱依次为：全方﹥清热方﹥散结方﹥化痰方。　　结论：　　①清热化痰散结方及其拆方均能抑制人肺癌细胞 SK-MES和NCI-H69的增殖。②清热化痰散结方及其拆方主要将人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69阻滞于 S期从而抑制细胞增殖。③清热化痰散结方及其拆方均能抑制人肺癌细胞SK-MES和 NCI-H69 PI3K、Akt、mTOR蛋白的表达，进而抑制人肺癌细胞的增殖。④在肺癌的病变中，热毒、痰浊、瘀结与 PI3K-Akt-mTOR信号通路蛋白表达密切相关。

目录

声明

前言

材料与方法

1材料

2方法

3 统计学方法

结果

1 最佳抑制肺癌细胞增殖的药物

2 单味药对SK-MES、NCI-H69细胞增殖抑制作用的量效关系

3 正交试验设计方案及结果

4 清热化痰散结方及其拆方对 SK-MES、NCI-H69 细胞增殖抑制作用的量效关系

5 清热化痰散结方及其拆方对 SK-MES、NCI-H69 细胞增殖抑制作用的时效关系

6 清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞细胞形态的影响

7 清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞细胞周期的影响

8 清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白表达影响

讨论

1 抑制肺癌细胞株 SK-MES 和 NCI-H69 细胞增殖的中药筛选

2 清热化痰散结方的方义分析

3 清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞量效和时效的影响

4 清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞细胞形态的影响

5 清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞细胞周期的影响

6 清热化痰散结方及其拆方对SK-MES、NCI-H69细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的影响

结论

致谢

参考文献

附录1 清热化痰散结方及其拆方对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69细胞形态的影响

1.清热化痰散结方及其拆方对人肺鳞癌细胞SK-MES细胞形态的影响

2.清热化痰散结方及其拆方对人小细胞肺癌细胞 NCI-H69 细胞形态的影响

附录2 清热化痰散结方及其拆方对人肺癌细胞SK-MES和NCI-H69细胞周期的影响

1. 清热化痰散结方及其拆方对人肺鳞癌细胞SK-MES细胞周期的影响

2. 清热化痰散结方及其拆方对人小细胞肺癌细胞NCI-H69细胞周期的影响

附录3 文献综述:小细胞肺癌信号转导的研究进展

附录4 硕士研究生期间参加课题和发表论文情况