参附益心颗粒改善野百合碱诱导肺动脉高压大鼠氧化应激水平的研究

摘要

研究背景：　　肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）是一类预后不良的肺血管疾病，它的主要特征为肺动脉压力增高，在疾病形成过程中可伴或不伴有肺动脉病变，可以独立发生，也可为并发症，还可为一组临床综合征，但最终往往演变为右心衰竭和死亡。其发病机制相对复杂，目前尚未完全阐明，主要包括氧化应激、缺氧、基因突变、遗传、炎症、神经体液以及离子通道等多个方面。近年来发现氧化应激与肺动脉高压关系极其密切，并逐渐成为其机制探讨研究的焦点。氧化应激(oxidative stress)是指在有害条件影响机体时，体内氧自由基产生过多，机体对其消除能力相对有限，最终导致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)在体内蓄积，引起一系列氧化损伤的过程。乙酰半胱氨酸作为经典的抗氧化剂，可在氧化还原反应中生成还原型谷胱甘肽，具有极强的肺内皮细胞保护功能，目前广泛用于肺血管相关疾病的治疗，因此，将其作为本实验的阳性对照药物。　　随着对肺动脉高压发病机制的深入研究，目前已有多种新型靶向治疗药物相继问世，主要有磷酸二酯酶抑制剂、内皮素受体拮抗剂、可溶性鸟苷酸环化酶激活剂、前列环素衍生物以及钙离子通道阻滞剂等。这些药物疗效虽肯定，但长期服用副作用大，经济负担重，且并不是所有类型的肺动脉高压都适用。介入治疗和外科手术治疗也因其手术风险较大、并发症较多，因此也只在必要时应用。而中药作为当今发展的新兴产业，以中草药为原料，药性平和，药效持久。因此，利用中医中药治疗肺动脉高压的思路引起了广泛关注。参附益心颗粒是在孙教授经验方的基础上加以创新，主要由人参、益母草、桂枝、丹参、葶苈子等组成，起到活血化瘀、益气温阳、利水去饮的作用。多项前期动物实验研究及临床观察已证实参附益心颗粒不仅能改善心力衰竭及抑制心衰所致心肌肥厚，还能显著缓解肺动脉高压大鼠肺动脉压力，增加心输出量和心指数，改善肺动脉高压。但参附益心颗粒对肺动脉高压的干预作用是否是通过改善其氧化应激水平尚未得到完全认识。　　目的：　　本研究拟通过注射野百合碱构建SD大鼠肺动脉高压模型，探讨参附益心颗粒对野百合碱所致肺动脉高压大鼠氧化应激损伤的保护作用及其作用机制，为临床应用奠定基础。　　方法：　　1、将Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠50只，随机分为5组（按随机数字表法），每组10只：正常对照组、PAH模型组、参附益心颗粒低剂量组、参附益心颗粒高剂量组、N-乙酰L半胱氨酸组。除正常对照组给予等量生理盐水颈背部皮下注射外，其余4组均给予50mg/kg野百合碱注射，正常饲养28天。28天后正常对照组、PAH模型组均每日给予2ml生理盐水灌胃；参附益心颗粒低剂量组每日给予参附益心颗粒5.475g/kg灌胃、参附益心颗粒高剂量组每日给予参附益心颗粒21.9g/kg灌胃、N-乙酰L半胱氨酸组每日给予N-乙酰L半胱氨酸300mg/kg灌胃。4周后达到实验终点。　　2、采用经颈外静脉右心导管法测定右心室收缩压（RVSP）、平均肺动脉压力（mPAP）；计算右心室/左心室+室间隔，即右心室肥厚指数。摘除心脏后，通过室间隔将心室分为右心室、左心室+室间隔，分别将二者称重后计算比值。取左肺下叶肺组织进行石蜡包埋切片后，行常规 HE染色，在电子显微镜下观察肺组织基本病理变化情况，摄片，采用图像分析系统分析后计算各组肺小动脉管壁厚/管外径比（WT%）和壁面积/管面积比（WA%）；行免疫组化α-SMA抗体染色，以观察血管肌化程度。采用硝酸盐还原酶法测定肺匀浆总一氧化氮（NO）浓度。ELISA方法测定肺匀浆8-异前列腺素、3-硝基酪氨酸含量。TBA法测定肺匀浆中丙二醛（MDA）含量。WST-1法测定肺匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。Western blot法检测肺匀浆中NADPH氧化酶的催化亚基NOX2和NOX4的蛋白表达水平。采用SPSS17.0统计软件对结果进行分析，各组实验数据结果以均数±标准差（-x±s）表示。两组间进行比较用独立样本t检验，多组间进行比较用one-way ANOVA分析，组间两两进行比较用NSK检验。P＜0.05为差异有统计学意义。　　结果：　　1、右心导管测得各造模组右心室收缩压（RVSP）、平均肺动脉压（mPAP）、右心室肥厚指数（RVHI）均高于正常对照组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。说明大鼠肺动脉高压已经形成，造模成功。参附益心颗粒治疗组与PAH模型组相比，RVSP、mPAP、RVHI均明显降低，且与中药剂量的增加成负相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　2、PAH模型组大鼠与正常对照组比较，其肺血管管腔狭窄程度、平滑肌增生程度、管腔肌化度非常明显；而参附益心颗粒治疗组与PAH模型组比较，其肺血管管腔狭窄程度、平滑肌增生程度、管腔肌化程度均明显改善，且随着中药剂量的增加，改善越明显。　　3、大鼠肺组织总NO检测结果提示，PAH模型组大鼠与正常对照组相比，NO含量显著降低；参附益心颗粒治疗组与PAH模型组比较，NO含量明显增加（P＜0.01），且高剂量组效果更好，优于抗氧化剂N-乙酰L半胱氨酸组（P＜0.05）。　　4、PAH模型组大鼠肺组织8-异前列腺素、MDA、3-硝基酪氨酸与正常对照组比较，各组值均增大，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。参附益心颗粒治疗组与PAH模型组相比，8-异前列腺素、MDA、3-硝基酪氨酸的含量均显著降低，且增加药物剂量后，降低程度更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　5、PAH模型组大鼠与正常对照组相比，抗氧化酶SOD活性明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。参附益心颗粒治疗组与PAH模型组比较，SOD活性明显增高（P＜0.05），且高剂量组疗效更优。而NADPH氧化酶催化亚基NOX2和NOX4蛋白的表达水平PAH模型组大鼠与正常对照组相比，蛋白表达上调。参附益心颗粒治疗组与模型组相比，NOX2和 NOX4的蛋白表达均明显降低，且与中药剂量的增加成负相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　结论：　　1、参附益心颗粒可减轻野百合碱诱导肺动脉高压大鼠平均肺动脉压和右心室收缩压，改善右心室肥厚和肺血管重构改变。　　2、参附益心颗粒可能通过增加肺组织内NO浓度来调节血管舒缩失衡，改善肺动脉高压。　　3、参附益心颗粒可能通过降低氧化应激损伤，下调氧化酶蛋白的表达，增加抗氧化因子的活性来改善肺动脉高压。

目录

声明

中英文缩写词表

前言

材料与方法

1. 材料

2. 实验方法

3. 统计学处理

结果

1. 大鼠血流动力学变化和右心室肥厚指数比较：

2. 肺动脉形态学观察及相关数据比较

3. 参附益心颗粒对肺匀浆总一氧化氮（NO）、8-异前列腺素、MDA、3-硝基酪氨酸含量的影响

4. 参附益心颗粒对肺组织SOD活性、NOX2和NOX4蛋白表达水平的影响

讨论

肺动脉高压概述

传统医学对肺动脉高压的认识及参附益心颗粒的组方分析

野百合碱与肺动脉高压氧化应激模型的建立

氧化应激与肺动脉高压血管重构

氧化应激相关物质与肺动脉高压

结论

参考文献

致谢

附录 综述:肺动脉高压发病机制研究新进展