“脂肝方”对NASH大鼠肝细胞线粒体选择性自噬及其碎片降解机制的影响

摘要

目的：　　探讨“脂肝方”对非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）模型大鼠肝细胞线粒体选择性自噬及其碎片降解机制的干预效应。　　方法：　　采用随机数字表法将适应性喂养1周后的80只SD大鼠，随机分出10只8W空白组（第8周末处死）及10只12W空白组（第12周末处死）作为两个阶段的正常对照组，始终予以普通饲料喂养。其余60只以高脂饲料建立大鼠模型：高脂饲料喂养至8周时，随机分出10只作为8W模型组并处死；剩下50只随机分为脂肝方高剂量组、脂肝方中剂量组、脂肝方低剂量组、西药组及12W模型组各10只，继续予以高脂饲料喂养，同时在第8周至第12周期间进行药物干预，中药组大鼠分别给予高、中、低剂量脂肝方灌胃，西药组予立普妥灌胃，连续4周。此五组大鼠喂养至12周末处死并采集血液标本、肝脏标本，运用全自动生化仪检测大鼠血清AST、ALT、TG、TC的水平；高倍镜观察肝细胞病理分型，透射电镜观察线粒体自噬体超微结构，Western Blot检测LC3-II， P62，Fis1及Mfn1蛋白表达水平。　　结果：　　1、高脂模型组的血清TG、TC、AST、ALT较同期空白对照组明显升高（P＜0.01），病理学显示脂肪性炎症及脂质沉积比同期空白组严重。说明高脂饲料喂养的大鼠NASH模型造模成功，可用于后续实验中。　　2、12W模型组炎症细胞浸润度、肝组织坏死及肝细胞脂肪变性程度明显比8W模型组严重，12W模型组出现大量气球样变、Mallory小体、胶原纤维沉积等肝组织炎症反应现象；而8W模型组则较少或没有出现这些特殊病理学改变。提示第8周至12周高脂喂养的模型大鼠肝组织病变从NASLD向NASH阶段进展。　　3、与12W模型组比较，各治疗组的病理学显示肝组织脂肪性炎症及肝脂质沉积均有明显减轻与好转，且血清TC、TG、ALT及AST含量均明显降低（P均＜0.05）。其中脂肝方高剂量组改善最为显著。提示中药、西药均有改善NASH肝细胞病变的作用，且以高剂量脂肝方疗效最佳。　　4、电镜下观察肝细胞线粒体及自噬体超微结构，发现12W模型组肝细胞线粒体结构改变、碎片化数目明显多于12W空白组，自噬体数则明显减少。提示NASH肝细胞内存在线粒体损伤增多及自噬障碍。　　5.与同期模型组比较，各治疗组电镜下线粒体结构改变、碎片化数目明减少；线粒体自噬体数显著增多，其中以脂肝方高剂量组改变最明显。提示各治疗组均有改善线粒体损伤及细胞自噬进而保护肝细胞存活的作用，并以高剂量脂肝方效果最好。　　6、Western Blot结果显示，模型组与同期空白组相比，自噬特异蛋白P62明显升高，LC3-II蛋白表达则显著降低，线粒体分裂相关蛋白Fis1明显升高，融合相关蛋白Mfn1显著降低（P均＜0.01）。提示NASH大鼠肝细胞线粒体选择性自噬水平降低，线粒体分裂增多、融合出现障碍；与12W模型组相比，各治疗组大鼠的肝组织P62蛋白表达显著降低， LC3-II蛋白表达明显上升，Fis1蛋白水平明显降低，Mfn1蛋白水平显著升高（P均＜0.05），中药高剂量组在各蛋白表达水平上不同程度地优于其他治疗组，提示药物干预可以提高NASH大鼠肝细胞线粒体选择性自噬水平、抑制线粒体损伤进而减少肝细胞的凋亡，其中脂肝方高剂量组疗效最佳。　　结论：　　高脂饮食能引起大鼠的脂肪代谢紊乱，肝指数升高，肝细胞病理性炎症、线粒体损伤、自噬受限。脂肝方可明显改善NASH模型大鼠的肝脏脂质代谢及病理性炎症，并通过调节肝细胞线粒体选择性自噬、改善线粒体碎片降解机制进而保护肝细胞存活，起到拮抗NASH发生与发展的作用。实验证明抑制线粒体损伤及促进线粒体选择性自噬可能是脂肝方防治NASH获效的作用机制之一。

目录

声明

引言

第一部分 文献综述

1 NASH的现代医学研究进展

2 NASH的中医药研究进展

小结

第二部分 实验研究

1 材料

2 实验方法

3 统计学处理

4 结果

讨论

1导师对NASH病机与治法的认识

2中药复方“脂肝方”的组方分析

3．脂肝方治疗NASH大鼠模型的疗效机制探讨

问题与展望

结论

参考文献

缩 略 词 表

综述: 中医药治非酒精性脂肪性肝炎的研究进展

致谢

个人简介及攻读硕士期间获得的科研成果