海岛棉H276A雄性不育的细胞学与分子生物学基础研究

摘要

细胞质雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility,CMS)是植物杂种优势的利用的基础，并且已经广泛的应用于水稻、玉米等作物中。棉花（Gossypium barbadense L.）是重要的经济作物，也具有显著的杂种优势。但是由于其CMS资源的匮乏，导致杂种优势的利用受到了极大的限制。因此，开展棉花CMS不育分子机理研究，为更好的利用棉花杂种优势，具有重要的理论和实践意义。海岛棉CMS系H276A是刘冬梅等利用花粉管通道法通过转红麻HcPDIL5-2a基因创造的新型胞质不育系。该不育系是由其保持系H276B突变而来，所以其为细胞质近等基因系。在棉花CMS机理的研究中，可以排除由于线粒体基因组进化所造成的非CMS相关冗余遗传信息的干扰，为棉花CMS分子机理的研究提供了极有价值的研究材料。本研究从细胞学、线粒体基因组及转录组学对海岛棉CMS系H276A的败育机理进行了探索，得到以下主要结论:　　1.采用石蜡切片的方法对不育系和保持系的花药发育过程进行了比较分析，确定了海岛棉CMS系H276A花药败育开始于四分体时期，其败育特征主要是四分体细胞核液泡化，绒毡层在花药发育过程中完整、不发生降解。花药细胞超微结构观察发现，四分体时期不育系绒毡层细胞部分线粒体出现内膜降解现象。　　2.利用EcoRⅠ和HindⅢ两种限制性内切酶对不育系和保持系线粒体基因组进行RFLP分析。结果表明，使用EcoRⅠ进行单酶切时，atp1、nad4、nad7、nad9、ccmb在不育系和保持系之间呈现多态性，使用HindⅢ进行单酶切时，atp4、nad5、nad9、sdh4、cox3在不育系和保持系之间呈现多态性，其它基因则不表现多态性。以上结果表明，不育系H276A在线粒体基因atp1、atp4、nad4、nad5、nad7、nad9、sdh4、ccmb、cox3编码区或者编码区附近DNA水平上发生了突变，这些突变可能与棉花CMS的发生相关。　　3.以35个棉花线粒体蛋白编码基因为探针对不育系和保持系进行RNA blot分析，结果表明线粒体基因虽然不存在转录本长度多态性，但发现不育系中cox3基因转录本丰度显著降低（约是保持系的0.3-0.4倍），对cox3进一步进行荧光定量分析，表明该基因在不育系中的相对表达量是保持系中的0.39倍。由此推测cox3的异常表达与棉花CMS形成过程中能量缺失有关。　　4.利用RNA环化的方法对cox3基因的全长转录本进行分析，发现该基因在保持系中的全长转录本为1515bp，其转录起始位点和转录终止位点分别位于起始密码子(ATG)上游-412bp及下游1103bp处。在不育系H276A中cox3的转录终止位点与保持系相同，然而却有三个不同的转录起始位点分别位于起始密码子上游-473、-466和-451处。对cox3基因上游序列进行克隆测序发现，不育系中该基因转录起始位点附近发生了7SNPs突变。由此推测这7SNPs引起cox3在不育系中的转录识别位点发生改变从而导致该基因表达量显著降低。　　5.在ATP合成酶基因的相对表达量分析中，以保持系为对照，结果表明除atp4(0.94)外，不育系中atp1(0.7)、atp6(0.64)、atp8(0.59)、atp9(0.61)的表达水平显著降低。另一方面，在可育F1代中atp1(1.25)、atp4(2.06)、atp6(1.64)、atp8(1.55)和atp9(2.27)表达量显著升高。表明了恢复基因的引入提高了ATP合成酶基因的表达，同时也进一步确定了棉花CMS的发生与能量代谢缺失相关。　　6.采用同源克隆的方法对线粒体ATP合成酶5个基因进行RNA编辑分析，共检测到41个RNA编辑位点且都是C-T转换，其中完全编辑位点27个，不完全编辑位点14个。对RNA编辑位点的氨基酸变化进行分析发现，RNA编辑引起蛋白质多肽链中疏水氨基酸含量增加，导致蛋白质稳定性增强。另外，发现2个由RNA编辑产生的新的终止密码子，一个位于atp6第787位点，另一个位于atp9第223位点，但是比对不育系、保持系及可育F1代中的RNA编辑频率发现，ATP合成酶基因RNA编辑与棉花CMS没有直接的相关性。　　7.基于不育系H276A线粒体蛋白编码基因atp8基因上游6bp的缺失，开发了一对可以鉴别棉花雄性可育胞质和不育胞质的分子标签。对41份已知育性的棉花种质资源进行验证，结果表明该分子标签稳定、可靠，为棉花CMS胞质资源的选育提供了一个有力的工具。　　8.通过Illumina Hiseq4000测序平台对不育系和保持系进行转录组学的研究中，共检测到64，675个共同表达基因，筛选出3603个差异表达基因(5.57％)其中1363上调表达，2240个下调表达基因。对差异表达基因进行进一步生物信息学分析，发现76个差异表达基因参与了TCA循环、氧化磷酸化、糖酵解等与植物能量代谢相关途径，且大部分基因显著下调表达。同时，发现了一些编码PPR蛋白、MYB转录因子及花药特异表达的差异基因。随机选取了15个可能与棉花CMS相关的差异表达基因进行实时荧光定量验证，结果表明转录组测序结果可靠。对上述差异表达基因调控网络进一步深入的研究，可以帮助我们进一步阐明棉花细胞质雄性不育败育机制。

目录

声明

摘要

缩略词

1 前言

1．1 植物CMS细胞学研究

1．1．1 植物花药发育过程

1．1．2 植物CMS细胞学败育特征

1．2 植物CMS与线粒体基因组

1．2．1 植物线粒体基因组

1．2．2 植物CMS与线粒体嵌合基因

1．2．3 与植物CMS相关的线粒体未知序列

1．2．4 植物CMS与线粒体基因RNA编辑

1．2．5 植物CMS作用的分子机制

1．2．6 植物CMS的育性恢复机制

1．3 植物CMS转录组学研究

1．3．1 转录组学研究方法

1．3．2 转录组测序在植物CMS研究中的应用

1．4 棉花CMS研究进展

1．4．1 棉花CMS细胞学败育研究

1．4．2 棉花CMS线粒体基因组研究

1．4．3 棉花CMS转录组学研究

1．5 本研究目的与意义

2 棉花不育系H276A小孢子败育的细胞学观察

2．1 材料和方法

2．1．1 研究材料

2．1．2 实验仪器和试剂

2．1．3 花器官形态学观察

2．1．4 石蜡切片的制备

2．1．5 透射电镜的制备

2．1．6 线粒体复合体活性测定

2．2 结果与分析

2．2．1 H276A／H276B花器官形态特征观察

2．2．2 H276A／H276B花药发育过程比较分析

2．2．3 H276A／H276B叶片及花药超微结构观察

2．2．4 H276A／H276B花药线粒体复合体活性比较

2．3 讨论

2．3．1 棉花CMS败育的细胞学特征

2．3．2 棉花CMS败育的线粒体结构特征

2．3．3 棉花CMS败育的线粒体复合体活性

3 棉花不育系和保持系线粒体基因RFLP及转录本比较分析

3．1 材料和方法

3．1．1 研究材料

3．1．2 主要的试剂和实验仪器

3．1．3 总DNA的提取与纯化

3．1．4 总RNA提取与纯化

3．1．5 核酸杂交探针的制备

3．1．6 Southern blot分析

3．1．7 RNA blot分析

3．2 结果与分析

3．2．1 H276A／H276B总DNA和总RNA检测

3．2．2 核酸杂交探针的制备

3．2．2 H276A／H276B线粒体基因RFLP比较分析

3．2．3 H276A／H276B线粒体基因转录本分析

3．3 讨论

3．3．1 棉花CMS系及其保持系线粒体基因组比较研究

3．3．2 棉花CMS相关基因的线粒体基因转录本特征

4 棉花线粒体基因cox3全长转录本分析

4．1 材料与方法

4．1．1 研究材料

4．1．2 cDNA合成

4．1．3 cox3基因扩增、克隆及测序

4．1．4 RNA编辑分析

4．1．5 荧光定量分析

4．1．6 CR-RT-PCR(RNA环化)

4．2 结果与分析

4．2．1 H276A／H276B cox3基因蛋白编码区序列分析

4．2．2 H276A／H276B cox3基因相对表达量分析

4．2．3 H276A／H276B cox3基因转录本起始位点和终止位点获得

4．3 讨论

5 棉花不育胞质ATP合成酶基因分析及不育胞质分子标签的开发

5．1 材料与方法

5．1．1 研究材料

5．1．2 ATP合成酶基因比较分析

5．1．3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

5．2 结果与分析

5．2．1 H276A、H276B及F1代ATP合成酶基因序列分析

5．2．2 H276A、H276B及F1代ATP合成酶基因RNA blot分析

5．2．3 H276A、H276B及F1代ATP合成酶基因RNA编辑分析

5．2．4 H276A、H276B及F1代ATP合成酶基因相对表达量分析

5．2．5 棉花雄性不育胞质相关的分子标记开发

5．3 讨论

5．3．1 棉花线粒体基因RNA编辑分析

5．3．2 棉花MSC分子标记的应用

6 棉花不育系H276A及其保持系H276B花药转录组学比较分析

6．1 材料与方法

6．1．1 植物材料

6．1．2 转录组测序RNA提取

6．1．3 cDNA文库构建及Illumina测序

6．1．4 与参考基因组比对及新转录本预测

6．1．5 基因表达量分析

6．1．6 差异表达基因检测

6．1．7 差异表达基因GO功能分析

6．1．8 差异表达基因KEGG Pathway功能分析

6．1．9 转录组测序结果qRT-PCR验证

6．2 结果与分析

6．2．1 转录组测序总RNA质量检测

6．2．2 转录组测序质量分析

6．2．3 差异表达基因分析

6．2．4 差异表达基因的GO分析

6．2．5 差异表达基因的KEGG pathway分析

6．2．6 与柠檬酸循环相关的DEGs

6．2．7 与电子传递链和氧化磷酸化相关的DEGs

6．2．8 与糖酵解相关的DEGs

6．2．9 与PPR相关的DEGs

6．2．10 与转录因子相关的DEGs

6．2．11 qRT-PCR验证

6．3 讨论

6．3．1 能量缺失与CMS

6．3．2 MYB转录因子异常表达与CMS

6．3．3 PPR蛋白编码基因

6．3．4 其它差异表达基因

7 全文结论与讨论

7．1 主要结论

7．2 本研究的创新点

7．3 问题与展望

参考文献

附录

致谢

研究生期间科研和论文发表情况