Wnt/β-Catenin信号通路和Hippo信号通路在果蝇器官发育中新的调控机制研究

摘要

黑腹果蝇(Drosophila melenogaster)作为生命科学研究中重要的模式生物被广泛应用于筛选新的功能基因。本项研究使用功能获得性筛选策略，从655个与生长相关基因的过表达文库中发现了两个调控因子Nek2和Licome，它们分别参与了调控影响细胞生长和器官发育的Wnt/β-Catenin信号通路和Hippo信号通路。
　　进化上高度保守的Wnt/β-Catenin信号通路对生物的生长、发育、干细胞和稳态的维持有非常重要的作用。在本项研究中，我们发现蛋白激酶Nek2通过与该通路的调控因子Dsh的PDZ结构域相互作用从而对Dsh进行多重磷酸化。一方面Nek2对Dsh N端进行磷酸化从而迅速激活Wnt/β-Catenin信号通路;另一方面Nek2又可以对DshC端进行磷酸化，降低Dsh蛋白稳定性而促进其被降解。这种双重磷酸化修饰可以在Wnt信号开启时迅速激活，又可以通过促进Dsh降解以防止其被过度激活。另外我们还发现在激活Wnt信号上Nek2与Dco(CKlε同源物)具有功能冗余性，同时敲低Nek2和dco可以抑制Wnt/β-Catenin信号通路调控的靶基因表达及果蝇器官发育。
　　Hippo信号通路在细胞增殖与组织生长中起着非常重要的作用，它的失调常与肿瘤发生相关。其核心信号转导机制是Hippo激酶在支架蛋白Salvador和Mats的介导下磷酸化Wans之后促进其对辅助转录因子Yorkie的磷酸化，后者与14-3-3蛋白相互作用滞留在细胞质中进而被降解，抑制Hippo信号通路调控的靶基因的转录。在本项研究中，我们发现Hippo信号通路与p38 MAPK信号通路之间存在交叉联系。在果蝇翅膀成虫盘上过表达licorne或其上游的Mekk1时，激活Hippo信号通路调控的靶基因wg、ex、Diap-1和ban的转录及促进器官生长;同时在果蝇卵巢滤泡细胞中，licorne突变可以观察到ex和cut的减弱以及FasⅢ的增强，这与orkie突变的表型一致。通过遗传学上位分析，证明licrone位于wts和yki的上游，并且licorne和Mekk1对Hippo信号通路的调控依赖于p38b;此外，我们还发现p38 MAPK信号通路通过促进F-actin的聚集来抑制Hippo信号通路;最后，在哺乳动物细胞中，MKK3（Licorne的同源蛋白）促进YAP入核以及上调其下游靶基因CTGF和Cyr61的转录，说明Licorne对Hippo信号通路的调控机制在进化过程中高度保守。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 前言

1．2 Wnt／β-Catenin信号通路

1．2．1 Wnt／β-Catenin信号通路研究历史

1．2．2 Wnt蛋白的分泌及胞外运输

1．2．3 Wnt／β-Catenin信号通路受体和拮抗剂／激动剂

1．2．4 Wnt／β-Catenin信号通路关闭状态

1．2．5 Wnt／β-Catenin信号通路开启状态

1．2．6 β-Cantenin的调控及生物学功能

1．2．7 Wnt信号通路与疾病

1．3 Nek2激酶结构与功能

1．4 Hippo信号通路

1．4．1 Hippo信号通路概述

1．4．2 Fat支路

1．4．3 Expanded-Merlin-Kibra复合物

1．4．4 细胞极性决定因子

1．4．5 F-actin对Hippo信号通路的影响

1．4．6 STRIPAK复合物

1．4．7 E3泛素连接酶

1．4．8 转录调控

1．4．9 果蝇不同组织细胞中的Hippo信号通路

1．4．10 Hippo信号通路与癌症

1．5 p38MAPK信号通路概述

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 果蝇培养条件及品系

2．1．2 抗体

2．1．3 细胞株及培养条件

2．1．4 部分引物和质粒

2．2 试剂和仪器

2．3 缓冲溶液

2．3．1 免疫荧光染色

2．3．2 蛋白免疫印迹

2．3．3 免疫共沉淀

2．3．4 蛋白去磷酸化(CIP实验)

2．3．5 GST蛋白纯化

2．3．6 体外磷酸化

2．3．7 大肠杆菌培养基(1L)

2．3．8 果蝇培养基(1L)

2．3．9 Single fly PCR buffer

2．4 试验方法

2．4．1 GST蛋白纯化

2．4．2 免疫共沉淀

2．4．3 体外磷酸化

2．4．4 蛋白去磷酸化实验

2．4．5 蛋白免疫印迹

2．4．6 果蝇幼虫成虫盘免疫荧光染色

2．4．7 果蝇卵巢滤泡细胞免疫荧光染色

2．4．8 MCF-10A细胞免疫荧光染色

2．4．9 F-actin染色

2．4．10 细胞冻存与复苏

2．4．11 细胞转染

2．4．12 RNA抽提

2．4．13 反转录

2．4．14 荧光定量PCR

2．4．15 双链RNA(dsRNA)制备

2．4．16 果蝇细胞内RNA干扰

2．4．17 Luciferase Assay

2．4．18 分子生物学常规方法

2．4．19 Single fly PCR

2．4．20 Gal4-UAS系统

2．4．21 FLP-FRT技术

2．4．22 MARCM技术

2．4．23 平衡染色体技术

第三章 Nek2激酶调控Wnt／β-Catenin信号通路的机理

3．1 过表达Nek2激活Wnt／β-Catenin信号通路

3．2 Nek2依赖核内转录因子复合物激活Wnt／β-Catenin信号通路

3．3 Nek2位于Dsh上游

3．4 Nek2对Dsh的多重磷酸化

3．5 Nek2磷酸化Dsh N端上调Wnt／β-Catenin信号通路

3．6 Nek2磷酸化Dsh C端促进其降解

3．7 Nek2磷酸化Dsh的综合作用

3．8 体内敏感型背景下敲低Nek2抑制Wnt／β-Catenin信号通路

3．9 CKIε是Nek2的功能冗余基因

3．10 讨论

第四章 Lic／p38 MAPK信号通路对Hippo信号通路的调控

4．1 Lic过表达上调Hippo信号通路靶基因

4．2 Lic过表达激活Yki

4．3 lic缺失在翅膀成虫盘上不影响Hippo信号通路靶基因的表达

4．4 lic缺失在卵巢滤泡细胞中激活Hippo信号通路

4．5 Lic位于Wts和Yki的上游

4．6 Lic对Hippo信号通路的调控与凋亡和JNK信号通路无关

4．7 Lic抑制Hippo信号通路依赖于p38b

4．8 Mekk1抑制Hippo信号通路部分依赖于p38b

4．9 p38 MAPK信号通路通过促进F-actin聚集抑制Hippo信号通路

4．10 果蝇中Lic促进F-actin的聚集不依赖于Hsp27和MK2

4．11 Ras、Rac1和RhoGEF2激活F-actin的聚集和Hippo信号通路靶基因不依赖于p38 MAPK信号通路

4．12 Lic调控Hippo信号通路在哺乳动物细胞中保守

4．13 讨论

第五章 总结

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果