JAK2/STAT3信号通路对糖尿病心肌病心肌纤维化的影响及外源性硫化氢干预作用

摘要

目的：　　探讨JAK2/STAT3信号通路介导的炎症反应对糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopatHy，DCM)大鼠心肌纤维化的影响，在此基础上探讨外源性硫化氢(Hydrogen sulfide，H2S)通过JAK2/STAT3信号通路影响DCM心肌纤维化的机制，并在体外实验中进一步验证H2S对JAK2/STAT3信号通路及高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。旨在进一步揭示DCM心肌纤维化发生发展的机制，为寻找治疗DCM的新靶点、开发新的治疗药物提供理论依据和实验数据。　　方法：　　1.JAK2/STAT3信号通路与DCM心肌纤维化的相关性研究。运用高糖高脂饮食联合链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)腹腔注射方法建立雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠2型糖尿病DCM模型，结合JAK2特异性抑制剂AG490干预研究JAK2/STAT3信号通路对大鼠DCM心肌纤维化和心脏功能的影响及机制。4周龄健康雄性SD大鼠50只，随机选取20只大鼠，随机数字表法分成对照+安慰剂组(Control+DMSO)、对照+JAK2抑制剂组(Control+AG490)，每组10只。另外30只予以高糖高脂饮食喂养4周后，小负荷剂量STZ(40mg/kg)一次性腹腔注射建立大鼠2型糖尿病模型。选取STZ注射后3-5天多次尾静脉随机血糖＞16.7mmol/L的大鼠20只，随机分成DCM+安慰剂组(DCM+DMSO)、DCM+JAK2抑制剂组(DCM+AG490)，每组10只。造模成功后各组大鼠均予以正常饮食喂养，第8周起抑制剂组大鼠予以JAK2抑制剂AG490(5mg/kg)每周3次腹腔注射干预，安慰剂组予以等量有机溶剂DMSO代替。第12周末运用心脏彩超检查评估大鼠心脏舒缩功能;完成后用过量2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉安乐处死大鼠，并灌注留取左室心肌组织提取蛋白、制作常规石蜡切片和冰冻切片。运用蛋白免疫印迹(Western blot，WB)检测各组大鼠心肌JAK2/STAT3信号通路蛋白变化情况;酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)方法检测JAK2/STAT3下游炎性细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平。运用天狼星红染色观察大鼠心肌纤维化情况并计算胶原纤维容积分数(Collagen volume fraction，CVF);运用WB技术检测大鼠心肌组织Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达情况;运用免疫荧光染色观察心肌成纤维细胞分布情况，并进行统计分析。　　2.外源性H2S对DCM心肌纤维化及JAK2/STAT3信号通路的影响研究。SD大鼠DCM模型建立方法同第一部分，运用硫氢化钠作为外源性H2S供体。选取STZ注射后3-5天多次尾静脉随机血糖＞16.7mmol/L的SD大鼠20只随机分成DCM+安慰剂组(DCM+Saline)、DCM+硫化氢组(DCM+H2S)，每组10只。另取20只未建立DCM模型的SD大鼠随机分成对照+安慰剂组(Control+Saline)、对照十硫化氢组(Control+H2S)，每组10只。从DCM造模成功后第8周起，H2S组大鼠腹腔注射NaHS溶液100μMol·kg-1·d-1，安慰剂组腹腔注射等量0.9％氯化钠注射液代替。第12周末运用超声心动图评估大鼠心脏舒缩功能;完成后用过量戊巴比妥钠腹腔注射麻醉安乐处死大鼠，并运用心脏灌注方法留取左心室心肌组织，用于提取蛋白、制作常规石蜡切片和冰冻切片。运用WB检测JAK2/STAT3信号通路变化情况;运用ELISA方法检测炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平。运用天狼星红染色观察大鼠心肌纤维化情况并计算CVF;运用WB检测大鼠心肌组织Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达情况;运用免疫荧光染色观察心肌成纤维细胞分布情况，并进行统计分析。　　3.体外实验中验证硫化氢对JAK2/STAT3信号通路和高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响。取8只3日龄的SD大鼠新生鼠心脏组织并提取细胞，运用差速贴壁法分离纯化心肌成纤维细胞，并运用心肌成纤维细胞特异性标志物波形蛋白(Vimentin)抗体行免疫荧光染色鉴定细胞纯度。运用JAK2激动剂库马霉素A1(CoumamycinA1，CoumA1)干预激活JAK2/STAT3信号通路。取等量细胞接种于6孔板中，4×105/孔，完全培养基培养过夜待细胞贴壁。第二天依次更换培养基为：低糖DMEM培养基组(Low glucose，LG)、高糖DMEM培养基(HigH glucose，HG)、高糖DMEM培养基+硫化氢(HG+H2S)、高糖DMEM培养基+硫化氢+JAK2激动剂组(HG+H2S+CoumAl)。于更换高糖培养基后24小时、48小时和72小时倒置相差显微镜下观察心肌成纤维细胞的生长情况;运用CFDA-SE法检测各组细胞增殖情况;运用WB检测72小时后各组细胞JAK2/STAT3信号通路活化情况和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达情况;运用ELISA法检测细胞上清液炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平。　　结果：　　1.①与Control+DMSO组相比.DCM+DMSO组大鼠心肌组织中心肌成纤维细胞数量明显增加，Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达水平明显升高，CVF明显增加，心脏舒缩功能显著降低，均有统计学意义(p＜0.05)，提示DCM模型建立成功。虽然两组中总的JAK2和STAT3表达水平变化不明显，但pJAK2、pSTAT3蛋白的表达水平均明显升高(p＜0.05)，并与心肌纤维化水平呈正相关，提示JAK2/STAT3信号通路活化与DCM心肌纤维化密切相关。②与DCM+DMSO组相比，DCM+AG490组大鼠心肌组织pJAK2和pSTAT3的蛋白表达水平明显降低;Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达显著降低，心肌CVF明显降低，心脏舒缩功能显著改善，差异具有统计学意义(p＜0.05)。③进一步研究发现，与Control组相比，DCM组大鼠心肌中炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α明显升高，而AG490干预显著减少了炎症因子的表达。　　2.①与Control+Saline组相比，DCM+Saline组大鼠心肌组织中心肌成纤维细胞数量明显增加，Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达水平也明显升高，同时CVF明显增加，心脏舒缩功能降低;pJAK2、pSTAT3蛋白的表达水平明显升高;炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平也明显升高，差异具有统计学意义(均p＜0.05)。②与DCM+Saline组相比，DCM+H2S组大鼠心肌pJAK2、pSTAT3和IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平均明显降低;心肌成纤维细胞、Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和心肌CVF也明显降低，心脏舒缩功能显著改善(均p＜0.05)。　　3.①与LG组比较，HG组pJAK2和pSTAT3蛋白表达显著增加;心肌成纤维细胞增殖更加明显;Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达更多;细胞上清液炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平也明显升高，差异具有统计学意义(均p＜0.05)。②与HG组比较，H2S干预可以显著降低JAK2/STAT3信号通路的活化，减少下游炎症因子的释放，从而减轻心肌成纤维细胞增殖和Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。③与HG+H2S组比较，在H2S干预的基础上运用JAK2激动剂激活JAK2/STAT3信号通路，可显著削弱H2S对JAK2/STAT3信号通路和炎症因子释放的抑制作用，从而再次引起心肌成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成增加。　　结论：　　JAK2/STAT3信号通路过度活化介导的炎症反应在促进DCM心肌纤维化的进程中具有重要作用，外源性硫化氢可以通过抑制JAK2/STAT3信号通路的过度活化，减轻炎症反应，抑制心肌成纤维细胞的增殖和胶原纤维合成，从而减轻DCM的心肌纤维化，最终改善DCM心脏舒缩功能。基于H2S和JAK2/STAT3信号通路的干预策略可能是未来DCM治疗和药物开发的新靶点，值得进一步研究。

目录

摘要

前言

第一节 JAK2／STAT3信号通路与糖尿病心肌病心肌纤维化的相关性研究

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第二节 硫化氢对糖尿病心肌病心肌纤维化及JAK2／STAT3信号通路的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第三节 体外实验研究硫化氢对高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

全文总结

参考文献

英汉缩略词表

致谢

长链非编码RNA在糖尿病心肌病中的研究进展 综述

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