新型磷酸钙复合骨水泥对大鼠骨髓间充质干细胞生物相容性及成骨分化的研究

摘要

目的：研究新型磷酸钙复合骨水泥（磷酸钙骨水泥/骨基质明胶、磷酸钙骨水泥/骨基质明胶+聚乳酸-羟基乙酸共聚物空白微球）对大鼠骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cell，BMSCs)的体外骨诱导活性及细胞毒性。以期获得一种适合骨缺损修复的新型人工复合骨水泥，尤其能够作为骨质疏松压缩性骨折的骨修复材料。　　方法：1.通过W/O/W微球制备法自制聚乳酸-羟基乙酸共聚物空白微球（PLGA空白微球），称重分装并紫外线灭菌备用，按特定比例加入复合骨水泥;采用Urist等方法利用兔四肢长骨干经粉碎、脱脂脱钙等处理后制得骨基质明胶骨粉(BMG)，将骨基质明胶骨粉称重分装并环氧乙烷灭菌备用。2.依据前期实验结果，在磷酸钙骨水泥(CPC)与骨基质明胶骨粉按5∶1混合的基础上再按总重量的5％加入PLGA空白微球，再与固化液均匀搅拌，注射进预制的塑料模具制成圆柱状的新型磷酸钙复合骨水泥，同理制得单纯的CPC组、及不含微球的复合骨水泥组，并通过完全培养基的浸泡后制成三组材料的浸提液。3.选用3周龄左右体重在80-100g的SD大鼠，在分离大鼠骨髓间充质干细胞时采用全骨髓贴壁培养法，通过三次传代后得到生长旺盛、形态稳定的P3代细胞。4.将实验组分为CPC组（A组）、CPC∶BMG组（B组）、CPC∶BMG+5％PLGA组（C组）三个实验组，扫描电镜观察所制备的微球、骨基质明胶及CPC和复合骨水泥的微观结构，通过观察细胞在材料上的粘附情况及细胞粘附率的测定评估大鼠骨髓间充质干细胞在上述材料上的粘附能力;通过细胞溶血实验、Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒测定新型磷酸钙人工复合材料对大鼠骨髓间充质干细胞的毒性作用;通过碱性磷酸酶测试盒测定新型磷酸钙人工复合骨水泥在大鼠骨髓间充质干细胞分化过程的碱性磷酸酶活性的变化情况;使用三组骨水泥的浸提液与大鼠骨髓间充质干细胞共培养并用基茜素红染色观察新型磷酸钙人工复合骨水泥对大鼠骨髓间充质干细胞诱导成骨作用。　　结果：经传代所获得的P3代细胞生长迅速，形态均一，多为长梭形，部分细胞团呈旋涡样生长，扫描电镜观察微球大小合适，形态圆，测量直径为70-130um之间，CPC及BMG表面具有较多孔隙，但前者孔隙小且数量相对较少。干细胞能在A、B及C三组材料上均能良好粘附生长，B组、C组上细胞明显较多，并可见细胞向孔隙内生长。CCK-8细胞毒性实验表明CPC/BMG及CPC/BMG+PLGA空白微球复合材料基本无细胞毒性，通过在材料中添加骨基质明胶可促进BMSCs增殖。PKA活性检测及茜素红染色结果表明CPC/BMG及CPC/BMG+PLGA空白微球复合材料能够促进BMSCs向成骨细胞分化并产生矿化物质，染色呈现不均匀红色。　　结论：PLGA微球与CPC/BMG混合后能够达到增大孔径的目的，利于细胞、营养物质及血管的流入，为细胞的爬行起到了支架作用，为新骨的形成提供了有利条件。在磷酸钙骨水泥中加入骨基质明胶后所得的新型复合材料具有良好的细胞生物相容性及骨诱导性，PLGA空白微球的加入能够进一步增大该复合材料的孔径及孔隙率，利于细胞的粘附聚集及移行入材料内。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验的仪器、材料

2 相关实验试剂及配制注意事项

3 PLGA空白微球、BMG及复合骨水泥的制备

4 主要试剂盒

5 实验方法

结果

1．大鼠骨髓间充质干细胞生长情况

2．扫描电镜观察情况

3．BMSCs在骨水泥材料上的粘附率

4．各组骨水泥的细胞溶血实验结果

5．CPC、CPC／BMG复合材料的浸提液对离体大鼠骨髓间充质干细胞的毒性分析

6．将大鼠骨髓间充质干细胞与三组材料浸提液共培养后诱导分化成骨效果的分析

讨论

结论

参考文献

中英文缩略词对照表

致谢

可注射新型骨水泥的研究进展 综述

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