KCNJ5基因突变对人肾上腺皮质腺癌H295R细胞分泌醛固酮的影响

摘要

目的：应用脂质体LipofectamineTM3000转染技术，探讨突变型KCNJ5G151R、delI157基因对人肾上腺皮质腺癌H295R细胞分泌醛固酮的影响。　　方法：构建野生型KCNJ5、突变型KCNJ5G151R、突变型KCNJ5delI157和空载体质粒，采用脂质体LipofectamineTM3000转染方法转染H295R细胞，将其分为野生型KCNJ5组、突变型KCNJ5G151R组、突变型KCNJ5delI157组和对照组。将质粒脂质体复合物转染H295R细胞后，更换为含和不含100nM(nmol/L)血管紧张素Ⅱ的培养基，以及含和不含10uM(umol/L)维拉帕米的培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养36小时。采用DiSBAC2荧光染料检测各组细胞膜电位变化;使用蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测各组细胞KCNJ5蛋白表达水平;应用放射免疫技术检测各组细胞上清液中醛固酮浓度;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR）技术检测细胞中11-β羟化酶(CYP11B1)、醛固酮合酶(CYP11B2)基因的表达水平。　　结果：①与对照组相比，两组转染KCNJ5G151R、KCNJ5delI157的H295R细胞质内荧光增强，差异有统计学意义(P＜0.05)。②KCNJ5蛋白在转染空载体质粒、野生型KCNJ5、突变型KCNJ5G151R、突变型KCNJ5delI157的H295R细胞中平均表达量为1.08±0.04、1.64±0.07、1.82±0.04、1.87±0.05。采用t检验将各实验组分别与对照组相比，野生型KCNJ5组、突变型KCNJ5G151R组、突变型KCNJ5delI157组KCNJ5蛋白表达均明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。突变型KCNJ5G151R组与KCNJ5delI157组比较，差异不显著（P＞0.05）。③使用放射免疫分析法检测上清液中醛固酮浓度，突变型KCNJ5G151R组是对照组的2.86倍(1.720±0.045vs0.600±0.039ng/ml,P＜0.05),突变型KCNJ5delI157组是对照组的2.26倍（1.356±0.036vs0.600±0.039ng/ml，P＜0.05），而野生型KCNJ5组与对照组差异不显著(0.636±0.053vs0.600±0.039ng/ml，P＞0.05）。④CYP11B1mRNA在对照组、野生型KCNJ5组、突变型KCNJ5G151R组、突变型KCNJ5delI157组细胞中表达量为1±0.439、1.244±0.774、4.404±0.820、3.089±0.691。采用t检验将各组与对照组相比，突变型KCNJ5G151R组、突变型KCNJ5delI157组H295R细胞中CYP11B1mRNA表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。野生型KCNJ5组与对照组比较，差异不显著（P＞0.05）。⑤CYP11B2mRNA在对照组、野生型KCNJ5组、突变型KCNJ5G151R组、突变型KCNJ5delI157组H295R细胞中表达量为1±0.106、1.302±0.275、2.644±0.063、1.736±0.269。采用t检验将各组与对照组相比，突变型KCNJ5G151R组、突变型KCNJ5delI157组H295R细胞CYP11B2mRNA表达明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。野生型KCNJ5组与对照组比较，差异不显著(P＞0.05)。⑥血管紧张素Ⅱ刺激后，转染突变型KCNJ5G151R的H295R细胞分泌醛固酮升高1.39倍(2.381±0.051vs1.704±0.045ng/ml，P＜0.05），转染突变型KCNJ5del1I57对的H295R细胞分泌醛固酮升高1.67倍(2.263±0.042vs1.349±0.046ng/ml，P＜0.05)。转染突变型KCNJ5G151R的H295R细胞中CYP11B1mRNA表达量增加（1.000±0.036vs1.466±0.161，P＜0.05），转染突变型KCNJ5G151R的H295R细胞中CYP11B2mRNA表达量增加(1.000±0.066vs1.806±0.166,P＜0.05)，转染突变型KCNJ5delI157的H295R细胞中CYP11B1mRNA表达量增加(0.796±0.104vs1.576±0.064,P＜0.05)，转染突变型KCNJ5delI157的H295R细胞中CYP11B2mRNA表达量增加（0.867±0.073vs2.116±0.052，P＜0.05)。⑦维拉帕米干预后，使转染突变型KCNJ5G151R的H295R细胞分泌醛固酮水平下降37.9％（1.720±0.045vs1.068±0.034ng/ml，P＜0.05)，转染突变型KCNJ5delI157的H295R细胞分泌醛固酮水平下降26.8％（1.356±0.036ng/mlvs0.992±0.046，P＜0.05）。转染突变型KCNJ5G151R的H295R细胞中CYP11B1mRNA表达量降低(4.044±1.020vs2.455±0.574，P＜0.05)，转染突变型KCNJ5G151R的H295R细胞中CYP11B2mRNA表达量降低(2.664±0.527vs1.266±0.401，P＜0.05)。转染突变型KCNJ5delI157的H295R细胞中CYP11B1mRNA表达量降低(8.053±1.038vs3.089±0.691，P＜0.05)，转染突变型KCNJ5delI157的H295R细胞中CYP11B2mRNA表达量降低(2.623±0.313vs1.736±0.469，P＜0.05)。　　结论：①突变型KCNJ5G151R和KCNJ5delI157可能通过使H295R细胞膜电位发生去极化，使醛固酮合酶基因CYP11B2表达水平增加，导致H295R细胞分泌的醛固酮增多。②血管紧张素Ⅱ刺激后，转染突变型KCNJ5G151R和KCNJ5delI157的H295R细胞中CYP11B2mRNA的表达及醛固酮分泌量增加。③维拉帕米干预后，转染突变型KCNJ5G151R和KCNJ5delI157的H295R细胞中CYP11B2mRNA的表达及醛固酮分泌量下降。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4、主要溶液的配置

5．实验方法

结果

1、人肾上腺皮质腺癌NCI-H295R细胞培养

2、H295R细胞的转染效率

4、KCNJ5基因对H295R细胞膜电位影响

5、KCNJ5基因对H295R细胞醛固酮分泌影响

5、KCNJ5基因对H295R细胞CYP11B1和CYP11B2表达影响

7、血管紧张素II对转染突变型KCNJ5G151R、KCNJ5delI157的H295R细胞影响

讨论

1、KCNJ5基因相关研究

2、KCNJ5基因突变对H295R细胞分泌醛固酮影响

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

原发性醛固酮增多症KCNJ5基因突变研究进展 综述

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