c-Ski基因对青光眼性视神经损伤保护作用及机制研究

摘要

本文从以下几个部分展开论述：　　第一部分 N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)诱导大鼠正常眼压青光眼模型的建立　　目的:探索N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)诱导大鼠正常眼压青光眼模型的最佳方案。　　方法:36只SD大鼠随机均分为4组，正常对照组(A组)，实验组27只右眼玻璃体腔注射NMDA5μl，依注射剂量20nmol，40nmol，80nmol随机等分为B组、C组、D组，左眼玻璃体内注射5μl PBS作为自身对照组（E组），分别于3d、7d、14d后处死大鼠摘除眼球。通过视网膜HE染色检测视网膜神经节细胞复合体(ganglion cell complex，GCC)厚度、TUNEL法检测视网膜神经节细胞层(ganglion cell layer，GCL)细胞凋亡率（apoptosis index，AI）。　　结果:1.视网膜HE染色发现经NMDA干预后的B、C、D组各时间点视网膜GCC厚度均比A组明显变薄(P＜0.05)，C组比B组更薄(P＜0.05)，B、C、D组14d比7d、3d的GCC更薄(P＜0.05)，而D组与C组间，B、C、D组7d与3d间，E组与A组间差异无统计学意义(P＞0.05)。2.TUNEL检测发现经NMDA干预后的B、C、D组各时间大鼠视网膜GCL细胞AI明显高于A组(P＜0.05)，C组比B组更高(P＜0.05)，B、C、D组14d比7d的更高(P＜0.05)，而D组与C组间，B、C、D组7d与3d间，E组与A组间差异无统计学意义(P＞0.05)。　　结论:使用NMDA建立正常眼压性青光眼大鼠模型的最佳剂量为40nmol，最佳取材时间为玻璃体腔注射NMDA后14天。　　第二部分 c-Ski基因过表达和干扰重组Ⅱ型腺相关病毒载体的构建　　目的:构建c-Ski基因过表达和干扰的重组Ⅱ型腺相关病毒(Recombinant typeⅡ adeno-associated viruses， rAAV2)表达载体，达到能进行基因治疗的动物实验的有效滴度。　　方法:构建同时表达c-Ski和绿色荧光(GFP)基因的重组Ⅱ型腺相关病毒载体（rAAV2-c-Ski/GFP），仅表达GFP基因的重组Ⅱ型腺相关病毒载体（rAAV2-GFP）作为对照。Real-Time PCR法检测病毒滴度。同法构建干扰c-Ski基因表达的重组Ⅱ型腺相关病毒载体(rAAV2-c-Ski-shRNA/GFP)。　　结果:成功构建c-Ski基因过表达的重组Ⅱ型腺相关病毒表达载体，经酶切和测序鉴定，仅有一处碱基改变，即第1476位的C突变为T，但所编码的氨基酸不受影响，其他序列完全相同。经293T细胞包装获得病毒rAAV2-c-Ski/GFP和rAAV2-GFP，病毒滴度均为1.55×1012 v.g./ml。同法获得病毒rAAV2-c-Ski-shRNA/GFP滴度为2.03×1013v.g./ml;rAAV2-NC-shRNA/GFP，滴度为1.56×1013 v.g./ml。　　结论:成功构建c-Ski基因过表达和干扰的重组Ⅱ型腺相关病毒表达载体，包装产生重组腺相关病毒，在293T细胞内验证了病毒滴度的有效性。　　第三部分 研究重组Ⅱ型腺相关病毒介导c-Ski基因过表达及干扰对青光眼性视神经损伤的作用　　目的:观察重组Ⅱ型腺相关病毒(Recombinant typeⅡ adeno-associatedviruses，rAAV2)介导c-Ski基因在视网膜的转染情况，探讨c-Ski对青光眼性视神经损伤的保护作用及可能的机制。方法:共128只雄性SD大鼠，将60只SD大鼠随机分为五组，A组:正常组、B组:青光眼组、C组:青光眼+rAAV2-c-Ski/GFP组、D组:青光眼+rAAV2-GFP组、E组:正常+rAAV2-c-Ski/GFP组，每组12只。将另外60只SD大鼠也随机分为五组，a组:正常组、 b组:青光眼组、 c组:青光眼+rAAV2-c-Ski-shRNA/GFP组、 d组:青光眼+ rAAV2-NC-shRNA/GFP组、 e组:正常+rAAV2-c-Ski-shRNA/GFP组，每组12只。再取8只SD大鼠随意分成两组，G组为玻璃体腔注射rAAV2-GFP组，S组为玻璃体腔注射rAAV2-c-Ski/GFP组。C、E、S组每只大鼠的右眼玻璃体腔注射5μl滴度为1.55×1012 v.g./ml的rAAV2-c-Ski/GFP，c、e组每只大鼠的右眼玻璃体腔注射5μl滴度为2.03×1013 v.g./ml的rAAV2-c-Ski-shRNA/GFP，D、G组每只大鼠的右眼玻璃体腔注射5μl滴度为1.55×1012 v.g./ml的rAAV2-GFP，d组每只大鼠的右眼玻璃体腔注射5μ1滴度为1.56×1013 v.g./ml的rAAV2-NC-shRNA/GFP;两周后B(b)、C(c)、D(d)组每只大鼠的右眼玻璃体腔注射5μl，剂量为40nmol的NMDA;玻璃体腔注射NMDA两周后行闪光视觉诱发电位(Flash-visual evoked potential，F-VEP)和视网膜电图（electroretinogram，ERG）检查，然后处死大鼠，取右眼球制作视网膜冰冻切片、视网膜铺片、石蜡切片、提取视网膜蛋白。视网膜冰冻切片观察rAAV2-GFP、rAAV2-e-Ski/GFP在视网膜的转染情况、视网膜HE染色检测各组的视网膜神经节细胞复合体(ganglion cell complex，GCC)厚度、TUNEL法检测各组视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)凋亡数、western bolt印迹法检测视网膜c-Ski蛋白、B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、BCL-2相关X蛋白(BCL2-associatedX protein，Bax)、转化生长因子-β2蛋白(transforming growth factor-β，TGF-β2)、Smad2蛋白、Smad3蛋白、磷酸化Smad2(p-Smad2)、磷酸化Smad3蛋白(p-Smad3)、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)相关蛋白(纤维连接蛋白(Fiberonectin，FN))、层粘连蛋白（Laminin，LN））表达情况。结果:1.荧光显微镜观察视网膜冰冻切片发现，rAAV2能成功介导c-Ski基因在视网膜中表达，绿色荧光(GFP)阳性转染细胞主要位于视网膜GCL。2.ERG及F-VEP检查发现， B(b)、C(c)、D(d)组b波振幅值及N1-P1振幅值较A(a)、E(e)组明显降低(P＜0.05)，C组经c-Ski基因干预后b波振幅值和N1-P1振幅值明显回升(P＜0.05)，而c组经c-Ski-shRNA干预后b波振幅值及N1-P1振幅值进一步明显降低(P＜0.05)。3.HE染色发现，B(b)、C(c)、D(d)组视网膜GCC厚度较A(a)、E(e)组明显变薄(P＜0.05)，C组经c-Ski基因干预后GCC厚度较B、D组增厚(P＜0.05)，而c组经c-Ski-shRNA干预后GCC厚度较b、d组进一步变薄(P＜0.05)。4.TUNEL检测发现B(b)、C(c)、D(d)组视网膜组织中RGC层凋亡神经元密度(ApoptoticNeurons Counts，ANC)（个/mm2）明显高于A(a)、E(e)组(P＜0.05)，C组经c-Ski基因干预后视网膜RGC层ANC明显低于B、D组(P＜0.05)，而c组经c-Ski-shRNA干预后视网膜RGC层ANC明显高于b、d组(P＜0.05)。5.Western Blot印迹检测发现C、E组视网膜c-Ski蛋白表达较A、B、D组显著增加(P＜0.05);而c、e组视网膜c-Ski蛋白表达较a、b、d组显著减少(P＜0.05);B(b)、C(c)、D(d)组与A(a)、E(e)组相比视网膜TGF-β2、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达量明显增加(P＜0.05)，C组经c-Ski干预后视网膜TGF-β2、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达量较B、D组降低(P＜0.05)，而c组经c-Ski-shRNA干预后视网膜TGF-β2、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达量较b、d组进一步增加(P＜0.05)，各组间视网膜Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达量变化没有差异;B(b)、C(c)、D(d)组与A(a)、E(e)组相比视网膜Bax/Bcl-2明显增加(P＜0.05)，C组经c-Ski干预后视网膜Bax/Bcl-2较B、D组降低(P＜0.05)，而c组经c-Ski-shRNA干预后视网膜Bax/Bcl-2较b、d组进一步增加(P＜0.05);B(b)、C(c)、D(d)组与A(a)、E(e)组相比视网膜FN、LN蛋白表达量明显增加（P＜0.05），C组经c-Ski干预后视网膜FN、LN蛋白表达量较B、D组降低(P＜0.05)，而c组经c-Ski-shRNA干预后视网膜FN、LN蛋白表达量与b、d组相比进一步增加(P＜0.05)。要位于视网膜GCL。2.rAAV2-c-Ski对正常眼压青光眼性视神经损伤具有一定保护作用，其可能机制是c-Ski通过抑制Smad2、Smad3磷酸化而抑制TGF-β/Smad信号通路，使视网膜ECM沉积减少，增加Bcl-2表达、降低Bax表达，从而减少RGC凋亡。

目录

摘要

前言

参考文献

第一部分 N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)诱导大鼠正常眼压青光眼模型的建立

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分c-Ski基因过表达和干扰表达重组Ⅱ型腺相关病毒载体的构建及包装纯化

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 研究重组Ⅱ型腺相关病毒介导c-Ski基因过表达及干扰对青光眼性视神经损伤的作用

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

英汉缩略语名词对照表

青光眼视神经损伤基因治疗的研究进展 综述

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