急性一氧化氮中毒后迟发型脑病大鼠海马区HIF-1α及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的动态表达

摘要

目的:本实验通过检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与胰岛素样生长因子-1(IGF-1)在大鼠DEACMP模型中的表达情况，初步探讨HIF-1α和IGF-1对DEACMP发病的影响及其在发病中的作用，为深入研究DEACMP提供实验基础。　　方法:1.健康雄性SD大鼠（体重300～350g，SPF级）156只，用随机数字表法分成三组:急性一氧化碳中毒迟发性脑病组（CO组）60只、空气对照组（AC组）60只、空白对照组（BC组）36只。2.各组大鼠进行Morris水迷宫实验:通过定位航行和空间探索实验训练大鼠学习记忆、定位认知能力。3.采用改良式腹腔注射CO法建立DEACMP模型:CO组采用多次间隔腹腔注射CO法复制DEACMP大鼠模型，AC组用相同的方法注射同等剂量的空气，BC组不作干预。选择中毒后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天作为六个时间点，然后按照CO组和AC组在每个时间点随机选取10只大鼠、BC组在每个时间点随机选择6只大鼠进行再次分组。4.评价造模是否成功:染毒后的大鼠再次行水迷宫试验，观察染毒前后的变化。5.HE染色观察海马CA1区的形态学变化，免疫组化SP法图像分析海马CA1区HIF-1α、IGF-1的表达，半定量western blot蛋白印迹法检测IGF-1的蛋白表达量，采用TUNEL染色检测其海马区锥体细胞凋亡情况。6.实验结果的统计学分析。　　结果:1.DEACMP模型的建立:(1)急性CO中毒症状:腹腔注射CO气体后陆续出现行为躁动→呼吸深大→拒食少动→精神萎靡等→动作迟缓、异常步态等表现;口唇、鼻、眼睛、趾端皮肤呈现明显的樱桃红色。部分大鼠出现抽搐、肢体强直、昏迷。AC组和BC组大鼠没有活动异常。(2)运用Morris水迷宫实验检测造模是否成功:1）定位航行试验:三组大鼠在染毒前平均逃避潜伏时间差异无统计学意义(P＞0.05);染毒后第14天、21天、28天，CO组平均逃避潜伏时间较染毒前延长，与两组对照组相比，有显著性意义(P＜0.01)。2)空间探索试验:①站台所在象限游走时间（第Ⅳ象限）:染毒前三组大鼠在第Ⅳ象限游走时间无统计学意义;CO组从染毒后第7天→第28天在第Ⅳ象限的运动时间逐渐缩短，且各时间点均比其余两组小，有显著性差异(P＜0.05)。②穿越平台次数:CO组从第1天至第28天（第28d时低于对照组）出现降低趋势，且各时间点比对照组都小;各组大鼠组内及组间在各时间点的实验结果无统计学意义(P＞0.05)。3.病理形态学改变:光镜下观察脑组织切片HE染色标本，CO组大鼠脑海马CA1区可见神经元变性坏死、神经细胞皱缩变形、锥体细胞数量减少、胞浆空泡增大等;空气对照组和空白对照组各时间点大鼠脑组织明显病理学改变不明显。4.HIF-1α及IGF-1蛋白表达:(1)免疫组化染色:①HIF-1α:CO组大鼠在染毒后第1天到第28天呈现先升高，至第3天达高峰后开始逐渐降低，但其各个时间点的表达量均高于两个对照组，差异具有显著性(P＜0.01);对照组各时间点表达量无统计学意义。②IGF-1:CO组从第1天→第28天表现为增高→降低→增高→降低的动态变化趋势，而AC组、BC组的表达量均比CO组低，结果具有显著性(P＜0.01)，空气对照组及空白对照组的结果差异无显著性。(2)半定量Western Blot法检测蛋白表达:与内参β-actin条带相比较， CO组IGF-1条带明显增粗，从第1天→第3天→第7天→第14天→第21天→第28天的变化趋势为升高→升高→降低→降低→升高→降低，与免疫组化结果相符。5.TUNEL染色检测细胞凋亡:CO组脑组织海马CA1区有锥体细胞的凋亡，凋亡数量从第1天到第28天呈现先增多，至第7天达最高峰后开始减少，第28天仍有凋亡;且CO组各时间点的凋亡指数较空气对照组及空白对照组均显著增高，差异有统计学意义(P＜0.01);对照组大鼠海马区未见明显细胞凋亡。　　结论:1.改良式腹腔注射CO法制备大鼠DEACMP模型，与人体发病的生理生化过程类似，且操作过程简单安全、外界影响小、实验剂量易控制，是一种比较符合DEACMP临床特点的动物模型。2.Morris水迷宫实验测试大鼠对空间定位及方向感的记忆能力，其认知功能的变化可作为判断造模是否成功的实验依据。3.CO中毒后HIF-1α可通过凋亡相关途径诱导神经细胞凋亡，而HIF-1α的增多可促进IGF-1的表达，在DEACMP的发病过程中IGF-1可能发挥了抗凋亡及保护神经的作用。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与器材

2 实验方法

结果

1 大鼠在造模中的行为表现

2 Morris水迷宫实验结果

3 HE染色结果

4 TUNEL染色检测细胞凋亡

5 HIF-1α免疫组化结果

6 IGF-1免疫组化染色表达

7 半定量IGF-1的蛋白表达情况

8 HIF-1α与凋亡指数的相关性分析

9 IGF-1与凋亡指数的相关性分析

10 HIF-1α与IGF-1的相关性分析

讨论

1 大鼠急性一氧化碳中毒迟发型脑病(DEACMP)模型的建立与评价

2 DEACMP大鼠海马区HE染色评价

3 DEACMP大鼠海马区TUNEL染色评价

4 HIF-1α在DEACMP模型中的表达

5．IGF-1在大鼠DEACMP模型中的表达

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

IGF-1与缺血缺氧性脑病 综述

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