PLGA--HA复合梯度支架联合髌下脂肪垫间充质干细胞与软骨细胞外泌体修复关节软骨病损的实验研究

摘要

目的：　　本研究第一部分通过对四种膝关节周围组织来源的间充质干细胞进行增殖能力、成软骨能力等比较，选择最适合用于软骨再生修复的自体种子细胞;第二部分通过软骨细胞与该最适间充质干细胞共培养，明确软骨细胞对该间充质干细胞的影响以及具体影响机制;第三部分则是结合前两部分结果通过体内研究明确最适合关节软骨再生修复的组织工程学方案。　　方法：　　本研究第一部分获取了髌下脂肪垫来源脂肪干细胞、皮下脂肪间充质干细胞，骨髓间充质干细胞，滑膜间充质干细胞，并通过比较四者增殖能力、三向分化能力以及诱导三向分化能力，选择向软骨方向分化能力更强的最适间充质干细胞用于作为关节软骨再生修复组织工程方案的种子细胞;第二部分通过软骨细胞与该间充质干细胞共培养，明确共培养对间充质干细胞表型的影响，并通过筛选软骨细胞影响间充质干细胞表型的主要机制（外泌体或者可溶性分泌因子）。第三部分选择新西兰大白兔作为实验动物，建立膝关节软骨损伤动物模型，结合前两部分研究结果，以PLGA-HA梯度复合支架为基础，结合不同治疗组合术后大体恢复情况和病理结果明确促进关节软骨再生修复的最佳组织工程学治疗方案。　　结果：　　本研究第一部分获取了髌下脂肪垫来源脂肪干细胞、皮下脂肪间充质干细胞，骨髓间充质干细胞，滑膜间充质干细胞，并通过增殖实验表明，髌下脂肪垫间充质干细胞与滑膜间充质干细胞的增殖能力优于其他两种间充质干细胞(P＜0.05)，而且髌下脂肪垫间充质干细胞与滑膜间充质干细胞的软骨分化特异性标志物的基因和蛋白表达量明显高于其他两种间充质干细胞(P＜0.05)，因此髌下脂肪垫间充质干细胞与滑膜间充质干细胞均具有成为优异的关节软骨修复种子细胞的潜力，考虑到临床髌下脂肪垫较滑膜组织更易获取，故而选用髌下脂肪垫间充质干细胞作为后续研究的关键细胞。第二部分通过髌下脂肪垫间充质干细胞与软骨细胞共培养，并与空白组共培养进行对照，对比发现软骨细胞可明显改变髌下脂肪垫间充质干细胞的表型，经过共培养后髌下脂肪垫间充质干细胞的增殖能力尽管无显著改变(P＞0.05)，但Col-2和Sox-9两种成软骨分化的特异性标志物基因表达显著升高(P＜0.05)，且Oct-4和Nucleostemin两种干性并标志物的基因表达水平明显降低(P＜0.05)，因此说明软骨细胞显著促进了髌下脂肪垫间充质干细胞成软骨方向分化。为明确软骨细胞调控髌下脂肪垫间充质干细胞的机制，本研究获取了软骨细胞分泌的外泌体以及分泌的可溶性细胞因子，分别作用于髌下脂肪垫间充质干细胞，再通过RT-PCR和Western Blot检测髌下脂肪垫间充质干细胞表型，结果显示软骨细胞外泌体干预组的髌下脂肪垫间充质干细胞表型改变与软骨细胞/髌下脂肪垫间充质干细胞共培养后的结果相似。因此可以判断软骨细胞可通过外泌体调控髌下脂肪垫间充质干细胞定向成软骨分化。第三部分基于前两部分结果，以PLGA-HA梯度复合支架为基础，设立4种治疗组合分组:A组-单纯支架组，B组-支架+软骨细胞外泌体组，C组-支架+髌下脂肪垫间充质干细胞组，D组-支架+髌下脂肪垫间充质干细胞+软骨细胞外泌体组。在术后4周，8周，12周获取组织标本，通过大体观，H&E染色，甲苯胺蓝染色明确修复疗效。结果显示D组的关节软骨损伤修复疗效最佳，C组较D组修复疗效稍差，但明显优于A组与B组，A、B两组的修复疗效相似，对关节软骨损伤的修复疗效均不理想。因此PLGA-HA梯度复合支架结合关节软骨外泌体以及髌下脂肪垫间充质干细胞联合修复关节软骨损伤是本研究种最佳的组织工程学修复方案。　　结论：　　经过本课题三个部分的研究明确了髌下脂肪垫间充质干细胞优异的成软骨能力，是未来关节软骨再生修复理想的种子细胞;而关节软骨可以通过分泌外泌体促进髌下脂肪垫间充质干细胞成软骨分化，这可能是目前单纯关节腔注射间充质干细胞可促进关节软骨损伤修复的可能的原因之一;另外本研究最终结果提示:PLGA-HA梯度复合支架结合关节软骨外泌体以及髌下脂肪垫间充质干细胞联合修复关节软骨损伤可获得较好的疗效，未来可进一步探索其临床转化价值，为临床治疗关节软骨损伤提供新的治疗思路。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章膝关节周围不同源性间充质干细胞成软骨能力对照研究

前言

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二章IPFP-MSCs与软骨细胞共培养促进IPFP-MSCs成软骨分化的机制研究

一、软骨细胞的提取、培养、鉴定

二、髌下脂肪垫间充质千细胞与软骨细胞共培养研究

三、讨论

第三章IPFP-MSCs联合软骨细胞及PLGA-HA支架修复软骨损伤的体内实验研究

前言

一、PLGA-HA支架制作及性能检测

二、动物实验

三、讨论

参考文献

综述

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢