miR-224-5p靶向PTEN介导胰腺黏液性囊腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化的机制研究

摘要

目的：胰腺黏液性囊性肿瘤(MucousCystic neoplasms，MCN)起源于胰腺导管上皮细胞，是胰腺囊性肿瘤常见类型之一，在胰腺肿瘤中比较少见。胰腺黏液性囊腺瘤有潜在恶性，癌变率高，长期随访证实，MCN可恶变为癌，即胰腺黏液性囊腺癌(Mucous Cystadenocarcinoma，MCC)。胰腺黏液性囊腺癌临床罕见，恶变机制不明，有学者认为胰腺黏液性囊腺癌起源于胰腺导管上皮细胞，亦有学者认为胰腺黏液性囊腺癌是由黏液性囊腺瘤恶变发展而来。在恶性肿瘤中 miRNAs 扮演着“癌基因”或“抑癌基因”的重要角色，miRNA可能成为肿瘤治疗的新靶点。miR-224-5p的表达具有组织特异性和时空特异性，其潜在发挥抗肿瘤效应与其数十种蛋白底物密切相关，而这些蛋白底物绝大多数为转录因子，其结合所产生的转录激活效应，涉及肿瘤发生、演进等几乎所有环节。有关胰腺黏液性囊腺癌这种罕见肿瘤的文献极少，我们课题组前期对MCN各阶段病变组织、囊液和血清miRNA 分别进行差异基因筛选，并通过qPCR 验证锚定关键分子miR-224-5p，但是，有关 miR-224-5p对胰腺黏液性囊腺癌细胞生物学功能影响及作用机制尚不清楚。本研究旨在明确 miR-224-5p在胰腺黏液性囊腺癌中的表达及对MCC-1细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间充质转化（Epithelial toMesenchymalTransition,EMT）生物学功能的影响，并探讨其作用机制。　　方法：本研究我们选用全世界仅有的一株人胰腺黏液性囊腺癌细胞株（ MCC-1细胞），通过MTT、划痕实验、Transwell assay等细胞学实验方法和动物实验方法，分别从细胞水平和体内水平探讨miR-224-5p对MCC-1细胞生物学影响，包括增殖、迁移、侵袭及其EMT的过程，以及作用机制。通过合成miR-224-5p mimic/inhibitor和构建miR-224-5p慢病毒表达载体，分别上调和下调MCC-1细胞中miR-224-5p的表达水平，使用MTT法检测细胞增殖活性的改变。Wound healingassay和Transwellassay用于检测细胞的迁移能力改变。Transwell assay检测细胞侵袭能力的变化。qRT-PCR实验检测细胞中EMT相关基因mRNA的变化。构建胰腺黏液性囊腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，体内检测miR-224-5p对MCC-1细胞成瘤能力的影响。应用常用的生物信息学软件（TargetScan，miRanda，Pictar）预测miR-224-5p与PTEN的结合位点。双荧光素酶报告实验验证miR-224-5p与靶基因PTEN直接结合关系。检测MCC-1细胞、转染慢病毒表达载体（过表达和低表达miR-224-5p）的MCC-1稳转细胞以及裸鼠皮下移植瘤中miR-224-5p表达水平和PTEN 的mRNA及蛋白水平表达水平，探讨miR-224-5p表达与PTEN表达的相关性。免疫组化方法检测4例胰腺黏液性囊腺癌患者病理切片中PTEN蛋白的表达情况。转染PTEN siRNA和PTEN质粒至相应的MCC-1细胞中进行功能回复实验，在MCC-1细胞中同时抑制miR-224-5p和PTEN的表达后观察MCC-1细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT能力的改变情况；以及在MCC-1细胞中同时过表达miR-224-5p和PTEN的表达后观察MCC-1细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT能力的改变情况。　　结果：与HPDE细胞相比较，胰腺粘液性囊腺癌MCC-1细胞中的miR-224-5p表达量显著升高，p＜0.01。将miR-224-5p慢病毒表达载体感染MCC-1细胞后进行感染效率检测，结果显示：与Lenti-control组相比较，Lenti-miR-224-mimic组能够明显上调MCC-1细胞内miR-224-5p表达水平， p＜0.01；Lenti-miR-224-inhibitor组能够下调MCC-1细胞miR-224-5p表达，p＜0.05。过表达miR-224-5p可促进MCC-1细胞的增殖能力，抑制miR-224-5p表达可减弱MCC-1细胞的增殖能力。体内裸鼠实验证实：稳定过表达miR-224-5p的MCC-1细胞接种裸鼠后，促进裸鼠皮下移植瘤的生长。miR-224-5p过表达可提高MCC-1细胞的迁移能力，p＜0.05，抑制MCC-1细胞内miR-224-5p表达水平可降低细胞的迁移能力，p＜0.05。miR-224-5p过表达可提高MCC-1细胞的侵袭能力，p＜0.05，miR-224-5p敲低表达可减弱MCC-1细胞的侵袭能力，p＜0.05。过表达miR-224-5p可促进MCC-1细胞上皮间充质转化，抑制miR-224-5p可减弱MCC-1细胞上皮间充质转化的过程。生信分析及双荧光素酶报告实验结果显示：鉴定PTEN是miR-224-5p的靶基因。与癌旁组织相比较，胰腺黏液性囊腺癌患者癌组织胞浆中的PTEN蛋白表达水平更低。在MCC-1细胞、转染慢病毒表达载体（过表达和低表达miR-224-5P）的MCC-1稳转细胞以及裸鼠皮下移植瘤中，miR-224-5p的表达水平和PTEN表达负相关。功能回复实验结果显示：抑制PTEN的表达能够逆转miR-224-5p-inhibitor抑制MCC-1细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间充质转化的效应， p＜0.05；增加PTEN的表达能逆转miR-224-5p-mimic促进MCC-1细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间充质转化的效应，p＜0.05。　　结论：上述研究结果揭示了 miR-224-5p对胰腺黏液性囊腺癌细胞的生物学功能的作用及机制，即 miR-224-5p在 MCC-1细胞中高表达，靶向抑制 PTEN表达，促进MCC-1细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间充质转化的作用。该研究揭示了在胰腺黏液性囊腺癌这一罕见癌种中，miR-224-5p 靶向 PTEN 介导胰腺黏液性囊腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化的功能新机制，将来有望利用该机制指导临床靶向和精准治疗。

目录

声明

英文缩略词

研究背景

上皮-间充质转化（EMT）与肿瘤

microRNAs与肿瘤

PTEN基因

第一部分Hsa-microRNA-224-5p在胰腺黏液性囊腺癌细胞中表达及对MCC-1细胞增殖能力的影响

前言

一、材料与方法

（一）实验材料

（二）实验方法

二、实验结果

（一）miR-224-5p在胰腺黏液性囊腺癌细胞中的表达情况

（二）miR-224-5p 慢病毒表达载体转染 MCC-1 细胞构建稳转细胞系

（三）MTT法检测miR-224-5p对MCC-1细胞增殖活性的影响

（四）miR-224-5p促进裸鼠皮下移植瘤的形成

（五）裸鼠胰腺黏液性囊腺癌皮下移植瘤中miR-224-5p检测

三、讨论

四、小结

第二部分Hsa-microRNA-224-5p对胰腺黏液性囊腺癌细胞迁移、侵袭和上皮间充质转化能力的影响

前言

一、材料与方法

（一）实验材料

（二）实验方法

二、实验结果

（一）细胞划痕实验检测miR-224-5p对MCC-1细胞迁移能力的影响

（二）Transwell迁移实验检测 miR-224-5p对 MCC-1细胞迁移能力的影响

（三）Transwell侵袭移实验检测 miR-224-5p对 MCC-1细胞侵袭能力的影响

（四）实时定量 PCR检测 miR-224-5p对 MCC-1细胞 EMT的影响

（五）裸鼠胰腺黏液性囊腺癌皮下移植瘤中 EMT 相关蛋白表达水平

三、讨论

四、小结

第三部分Hsa-microRNA-224-5p靶基因鉴定及其调控胰腺黏液性囊腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及EMT的机制

前言

一、材料与方法

（一）实验材料

（二）实验方法

二、实验结果

（一）miR-224-5p与PTEN靶基因双荧光素酶报告实验

（二）胰腺黏液性囊腺癌MCC-1细胞中PTEN mRNA及蛋白水平检测

（三）胰腺黏液性囊腺癌组织标本中 PTEN 蛋白免疫组化表达结果

（四）miR-224-5p对PTEN靶基因转录后水平的调控作用

（五）胰腺黏液性囊腺癌裸鼠皮下移植瘤中体内检测PTEN蛋白表达水平

（六）MCC-1细胞中PTEN siRNA和质粒的转染效率验证

（七）miR-224-5p 直接靶向 PTEN 调控 MCC-1细胞的增殖能力

（八）miR-224-5p直接靶向PTEN调控MCC-1细胞迁移能力

（九）miR-224-5p直接靶向PTEN调控MCC-1细胞侵袭能力

（十） miR-224-5p 靶向 PTEN调控 MCC-1细胞上皮间充质转化能力

三、讨论

四、小结

全文总结

展望

参考文献

综述:胰腺囊性肿瘤诊疗进展

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢