硫酸软骨素合成酶3敲除小鼠的高效构建及其在椎间盘退变中的研究

摘要

背景与目的　　下腰痛(Low back pain，LBP)极其常见，致残率高，严重影响患者的生活质量。每年因LBP产生的经济花费巨大，给家庭和社会带来沉重负担。目前认为，LBP的首要病因是椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration，IDD)。IDD主要表现为椎间盘含水量的降低及椎间隙狭窄。椎间盘的含水量主要由聚蛋白多糖决定，而聚蛋白多糖分子的保水能力则主要依赖于其侧链上的硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，CS)。CS主要由硫酸软骨素合成酶(Chondroitin synthase，CHSY)催化合成，然而CHSY在IDD中的作用还未阐明。我们的前期结果显示，人发生退变的椎间盘内Chsy3的表达量显著下降，并随着Pfirrmann退变分级的递增其表达量递减。　　由于IDD的发病机制复杂，目前缺乏能有效缓解或逆转IDD的治疗方法。因此，动物模型对深入研究IDD的机制及探索新的治疗方法极其重要。然而，国际上缺乏公认有效，且能够可控，并模拟正常退变进程的IDD动物模型。随着CRISPR-Cas9技术和半克隆技术的出现及优化，基因敲除小鼠的构建变得简单高效，并被广泛用于模拟人类疾病的研究中。因此，本研究拟构建Chsy3基因敲除小鼠模型，并进一步探索该动物模型在IDD中的应用研究。　　第一部分:硫酸软骨素合成酶3敲除小鼠的高效构建　　方法:　　(1)根据Chsy3的基因结构，设计并构建CRISPR-Cas9敲除质粒。(2)使用lipofectamine2000转染DKO-AG-haESCs。转染12小时后，使用流式细胞仪分选mCherry阳性的DKO-AG-haESCs，铺于6孔板上。(3)在显微镜下挑选单细胞克隆并进行基因鉴定，将鉴定好的DKO-AG-haESCs在6孔板上扩增，并使用流式细胞仪定期分选。(4)在体外，使用ICAHCI技术将受精卵发育至2细胞阶段，并移植入代孕母鼠体内，得到基因型为Chsy3+/-的F0代小鼠，交配至F2代小鼠。(5)对基因型为Chsy3-/-的F2代小鼠进行基因鉴定及潜在脱靶位点分析。　　结果:　　(1)在Chsy3的1号外显子上，成功构建pX330-mCherry-Chsy3-sgRNA的CRISPR-Cas9敲除质粒。(2)转染12小时后，mCherry阳性的DKO-AG-haESCs的比例为8.5％，利用流式细胞仪分选富集mCherry阳性的DKO-AG-haESCs。(3)挑选单细胞克隆，基因鉴定得到1株Chsy3基因型为-1bp移码突变敲除的单倍体细胞系。(4)使用ICAHCI技术，成功得到23只Chsy3+/-的F0代小鼠，并繁育至F2代小鼠。(5)成功得到Chsy3-/-的F2代小鼠，其基因型为-1bp。该小鼠H19-DMR和IG-DMR两个印记区域的基因型均为野生型。对前20个CRISPR-Cas9潜在脱靶位点进行测序鉴定，均无脱靶。　　结论:　　利用CRISPR-Cas9基因编辑技术和ICAHCI技术，成功高效构建出基因型为-1bp的Chsy3-/-F2代小鼠。同时，对前20个CRISPR-Cas9潜在脱靶位点进行测序鉴定，均未发现脱靶现象。　　第二部分:硫酸软骨素合成酶3敲除小鼠的发育及椎间盘退变分析　　方法:　　(1)在麻醉状态下，分别测量4周、6周、8周、10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周和24周的野生型小鼠和Chsy3-/-小鼠的体重和体长，观察小鼠生长发育情况。(2)对4周和8周的野生型小鼠和Chsy3-/-小鼠进行micro-CT检查，观察椎体及椎间隙变化。(3)对4周和8周的野生型小鼠和Chsy3-/-小鼠进行MRI检查，观察椎间盘信号变化。(4)通过免疫组化染色，检测野生型小鼠和Chsy3-/-小鼠髓核组织CHSY1、CHSY2、CHSY3和聚蛋白多糖的表达情况。(5)通过免疫组化染色，检测野生型小鼠和Chsy3-/-小鼠髓核组织中骨化相关基因OSTN和ENPP1的表达情况。　　结果:　　(1)野生型小鼠和Chsy3-/-小鼠的体重在各个时间点均无明显差异，但是Chsy3-/-小鼠的体长在4周以后均短于野生型小鼠，其差异有统计学意义。(2)在CT矢状位片上，4周和8周的Chsy3-/-小鼠的软骨终板明显钙化，并且椎间隙高度均低于野生型小鼠，其差异有统计学意义。(3)在MRI矢状位T2相上，4周和8周的Chsy3-/-小鼠的椎间盘退变分级均明显高于野生型小鼠，并且Chsy3-/-小鼠的椎间盘信号强度均明显低于野生型小鼠，其差异具有统计学意义。(4)与野生型小鼠相比，Chsy3-/-小鼠髓核组织的CHSY1的表达量略下降，聚蛋白多糖的表达量明显下降，CHSY3无表达。(5)与野生型小鼠相比，Chsy3-/-小鼠髓核组织的OSTN表达上调，而ENPP1的表达下调。　　结论:　　在发育上，Chsy3-/-小鼠的体重与野生型小鼠无明显差别，但其体长在4周以后均短于野生型小鼠。Chsy3-/-小鼠的CHSY1和聚蛋白多糖的表达下调、OSTN表达上调及ENPP1表达下调，进而导致椎间隙高度降低，软骨终板钙化，椎间盘退变分级增高，且椎间盘信号强度降低。　　第三部分:硫酸软骨素合成酶3敲除小鼠的椎间盘退变机制研究　　方法:　　(1)收集8周的野生型小鼠和Chsy3-/-小鼠的椎间盘组织进行原代培养。(2)利用高通量RNA-seq技术检测野生型小鼠和Chsy3-/-小鼠的椎间盘细胞的转录组表达水平。(3)通过生物信息学分析野生型小鼠和Chsy3-/-小、鼠的差异表达基因，并找到椎间盘退变的相关基因表达情况。(4)通过生物信息学分析野生型小鼠和Chsy3-/-小鼠的信号通路表达差异，找到引起椎间盘退变的潜在机制。(5)实验验证Chsy3敲除后椎间盘退变的潜在机制。　　结果:　　(1)通过椎间盘组织原代培养，成功建立野生型小鼠和Chsy3-/-小鼠的椎间盘细胞系共4株。(2)高通量RNA-seq技术发现，Chsy3-/-小鼠的椎间盘细胞的转录组基因表达水平和野生型小鼠的椎间盘细胞存在显著差异。(3)通过GO及GSEA分析发现，Chsy3-/-小鼠椎间盘细胞的骨化相关基因表达上调、细胞外基质分解基因明显上调及细胞外基质合成基因下调。(4)生物信息学分析发现Chsy3敲除后，Hippo信号通路显著下调，提示Hippo信号通路可能参与椎间盘退变。(5)实验验证Chsy3敲除后，YAP1及其下游TEAD表达下调，进一步导致椎间盘细胞的骨化基因和细胞外基质分解基因上调，细胞外基质合成基因下调，最终导致椎间盘退变。　　结论:　　利用高通量RNA-seq技术及生物信息学分析，发现Chsy3-/-小鼠椎间盘细胞的骨化相关基因表达上调、细胞外基质分解基因明显上调及细胞外基质合成基因下调，进而导致椎间盘退变。利用生物信息学预测出Chsy3敲除后，Hippo信号通路的下调是导致椎间盘退变的潜在机制，并利用相关实验技术进行了验证。　　小结：　　本研究利用CRISPR-Cas9技术和半克隆技术成功高效构建了Chsy3-/-小鼠模型，详细评估了Chsy3-/-小鼠椎间盘的变化，并利用高通量RNA-seq技术分析Chsy3影响IDD的作用机制。发现，Chsy3-/-小鼠的椎间盘发生进行性退变，表现为椎间盘含水量下降、椎间隙狭窄及软骨终板钙化。RNA-seq结果显示，Chsy3-/-小鼠的椎间盘细胞的转录组表达谱和野生型小鼠存在显著差异。Chsy3敲除后，Hippo信号通路中YAP1及其下游TEAD表达下调，一方面促进椎间盘细胞的骨化基因和细胞外基质分解基因的表达，另一方面抑制椎间盘细胞的细胞外基质合成基因的表达，进而共同导致IDD的发生及发展。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分：硫酸软骨素合成酶3敲除小鼠的高效构建

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第二部分：硫酸软骨素合成酶3敲除小鼠的发育及椎间盘退变分析

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第三部分：硫酸软骨素合成酶3敲除小鼠的椎间盘退变机制研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

全文总结

附录

文献综述1 椎间盘退变的动物模型研究进展

文献综述2 椎间盘退变的基因治疗研究进展

参考文献

在读期间主要学术活动说明

致谢