α--滑行蛋白TXLNA调控脑胶质瘤恶性生物学行为的机制研究

摘要

脑胶质瘤(Glioma)是最常见的中枢神经系统(CNS)的恶性肿瘤，其中最常见、恶性程度最高的是胶质母细胞瘤(GBM)。脑胶质瘤最根本、最有效的治疗方式是最大范围安全切除肿瘤辅以术后放化疗。尽管近年来随着免疫治疗、基因治疗等新治疗方法不断应用，脑胶质瘤的治疗手段有了较大的进步，然而对其治疗并未取得突破性进展，GBM患者的5年总生存率仅约5％，中位生存期仅约15个月。阐明脑胶质瘤发生发展的分子机制，探寻脑胶质瘤分子治疗靶点是当前神经肿瘤研究的重点。本研究旨在通过组织芯片技术、免疫组织化学技术检测TXLNA基因在脑胶质瘤中表达情况及其与脑胶质瘤患者预后的相关性，采用分子生物学及细胞生物学等技术方法探索TXLNA基因在脑胶质瘤发生发展中的生物学功能，为TXLNA基因成为脑胶质瘤临床预后预测标志物以及分子靶向治疗候选靶点提供依据。　　本课题组利用前期的基因表达谱芯片筛选出与脑胶质瘤患者预后显著相关的83个基因，本研究选定TXLNA基因深入研究其对于GBM预后判断的价值及其在脑胶质瘤发生发展过程中的作用。　　首先，从TCGA公共数据库下载了10例正常脑组织样本的基因表达数据和528例GBM样本的基因表达数据及对应的临床资料和随访数据，从中提取TXLNA基因的相关数据进行基因差异表达分析及生存分析，结果发现在GBM中TXLNA表达量较正常脑组织显著上调（7.023±0.032vs.5.284±0.0718，p＜0.0001），通过Kaplan-Meier生存分析发现TXLNA表达量与患者总生存期(OS)(p=0.0373)相关，与无进展生存期(PFS)(p=0.1360)相关性不显著。　　在数据库中初步验证TXLNA在GBM中表达上调且与患者预后具有相关性的基础上，本研究进一步收集了300例脑胶质瘤样本及16例正常脑组织样本，其中WHOⅠ级11例，WHOⅡ级109例，WHOⅢ级47例，WHOⅣ级133例;将上述样本制备成组织芯片，对其中随访数据完整的共100例原发性GBM样本及16例正常脑组织样本的免疫组化结果进行判读评分并统计分析，发现TXLNA在原发性GBM中表达较正常脑组织明显上调(p=0.0189);将100例原发性GBM依据TXL NA免疫组化结果分为TXLNA高表达组66例（＞3分）和TXLNA低表达组34例(≤3分)，通过Kaplan-Meier生存分析发现，TXLNA表达与原发性GBM患者OS(p=0.0006)和PFS(p=0.0001)均具有显著相关性，且TXLNA高表达对应更短的OS和PFS。通过单因素分析将p值＜0.2的临床因素进一步纳入多因素Cox比例风险回归模型，结果证实TXLNA高表达是原发GBM患者OS(HR=2.126，95％CI:1.293-3.497，p=0.003)及PFS(HR=2.530，95％CI:1.530-4.184，p＜0.001)的独立预后危险因素。　　为了深入探讨TXLNA在脑胶质瘤发生发展过程中的作用。本课题通过构建TXLNA基因的过表达质粒，包装慢病毒后感染U251细胞和GBM原代细胞，建立TXLNA稳定过表达细胞株;通过构建TXLNA敲除质粒，转染U251细胞和GBM原代细胞并用流式细胞仪分选单克隆建立TXLNA敲除细胞系;在此基础上检测TXLNA过表达、敲除分别对于U251细胞及GBM原代细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力和周期分布的影响。使用CCK-8及EdU检测U251细胞及GBM原代细胞增殖的结果显示:TXLNA过表达促进胶质瘤细胞的增殖;TXLNA敲除则抑制胶质瘤细胞增殖。克隆形成实验结果显示:TXLNA过表达促进胶质瘤细胞克隆形成;TXLNA敲除抑制胶质瘤细胞克隆形成。Transwell实验结果显示:TXLNA过表达促进胶质瘤细胞迁移和侵袭;TXLNA敲除抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭。流式细胞仪检测细胞周期实验结果显示:TXLNA过表达的胶质瘤细胞G1期细胞的比例显著减少，G2期细胞的比例显著增加;TXLNA敲除的胶质瘤细胞G1期细胞的比例显著增加，G2期细胞的比例显著减少。在细胞表型实验基础上，本研究进一步建立了裸鼠原位成瘤模型，实验结果显示:与注射TXLNA野生型胶质瘤细胞的荷瘤裸鼠比较，注射TXLNA敲除的胶质瘤细胞的荷瘤裸鼠生存期显著延长，表明TXLNA敲除能抑制胶质瘤细胞的体内成瘤能力。　　综上所述，本研究在前期通过基因表达谱芯片筛选得到与脑胶质瘤患者预后相关的差异表达基因TXLNA的基础上，通过TCGA数据库生物信息学分析在mRNA水平验证了TXLNA表达与GBM患者预后的相关性，通过组织芯片结合免疫组化在蛋白水平进一步验证了TXLNA表达与GBM患者预后的相关性，且证实TXLNA表达是原发GBM患者OS和PFS的独立预后危险因素。体外细胞表型实验证实TXLNA过表达可促进胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭、克隆形成及增高G2期细胞比例;TXLNA敲除抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭、克隆形成及减少G2期细胞比例。裸鼠体内原位成瘤实验证实脑胶质瘤TXLNA表达水平与荷瘤裸鼠生存期具有相关性，且敲除TXLNA抑制胶质瘤细胞体内成瘤能力。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

前言

第一部分TXLNA表达与GBM患者预后相关性分析

引言

材料和方法

结果

讨论

第二部分XLNA在脑胶质瘤中的功能和机制研究

引言

材料和方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述

攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢