脂肪瘤干细胞及脂肪干细胞的分离、培养、鉴别及生物信息学比较

摘要

目的：　　脂肪瘤(lipoma)是临床上最常见的良性体表肿瘤之一，可以发生在身体的任何部位，由单发或多发的体积大小不等的扁平团块所构成，呈圆形、椭圆形或不规则形，可被纤维组织所形成的间隔分割成多叶状。脂肪瘤瘤体表面皮肤通常无明显异常，当肿瘤较大时，局部可出现膨隆，高低不平。该病起病隐匿，进展较慢，临床症状较轻，偶于活动时出现局部酸涨感。　　当前脂肪瘤的治疗方法多为手术切除，切除后疗效尚佳，一般无复发，故该病在之前的很长一段时间并未引起学界重视。但随着社会进步所带来的人口生活压力增大、饮食结构逐渐向高蛋白高脂肪倾斜、不良生活习惯增加等因素的存在，整形外科脂肪瘤患者的就诊比例近年来逐渐增多。若肿瘤生长于暴露部位，手术所遗留的瘢痕可能对患者日常生活、社交构成影响;全身多发性脂肪瘤病，通过手术的方式无法将肿瘤全部切除，患者亦会终日忧心于其不断进展却无法找到根治手段从而产生其他心理障碍;还有一些其他特殊类型（如椎管内、颅内、肾脏）的脂肪瘤，如不及时处理，肿瘤逐渐增大，压迫重要血管神经，将引起不可逆转的器官功能障碍甚至危及患者生命，若行手术治疗，肿瘤周围解剖结构复杂，操作难度极大，且术后并发症较多。基于上述背景，有些临床医生将脂肪瘤的治疗方案移向了开放手术之外的其他领域如介入手术、瘤体注射、中医中药治疗等，效果不甚理想。囿于相关前序基础研究不足，当前对于脂肪瘤的治疗方法似乎并无新的突破。　　通过查阅文献得知，1958年Hewitt[1]等人发现，将白血病小鼠的肿瘤细胞移植到同种小鼠后，克隆集落形成仅占全部移植细胞的0.1％-1％，研究人员得出结论：肿瘤细胞中只有少数有限的细胞（肿瘤干细胞）具有功能异质性，这些细胞有高增殖、高分化能力和致瘤能力，可以持续增殖分化为相同或相似的肿瘤细胞。肿瘤干细胞在随后成为了研究肿瘤生发机制的新热点。2007年，Lin等人受此启发，首次分离出脂肪瘤干细胞(LSCs)并对其形态学进行了描述，并提及LSCs与脂肪干细胞(ADSCs)同源，并且有一定相关性[2]。ADSCs为成体多能干细胞，存在于人体正常脂肪组织，具有较强的增殖、分化能力，是组织工程新兴的种子细胞之一，其相关基础研究亦处于起步阶段，有文献提及其与脂肪瘤、脂肪肉瘤等软组织肿瘤关系密切。本课题以肿瘤干细胞学说为理论基础，试图寻找LSCs和ADSCs作为同源细胞，二者在形态学、生物动力学、生物信息学上的差异，从而了解脂肪瘤在生发过程中较正常脂肪组织有哪些改变，旨在1.完善脂肪来源干细胞分离培养的实验方法，明确取材原则;2.填补脂肪瘤相关基础实验研究的不足;3.以生物信息学角度来分析LSCs成瘤的关键节点。　　方法：　　1.以ADSCs为基准，应用酶消化法分离培养ADSCs，验证其干性，确认酶消化获取脂肪来源干细胞的有效性，比较不同年龄段来源ADSCs增殖分化能力，根据结果提示以筛选适合的脂肪瘤和脂肪标本：选取5个不同年龄组(12、21、31、41、68岁)脂肪组织，按照酶消化法提取干细胞的标准流程，分离出ADSCs并进行传代培养，观察传代至P2的细胞形态学特征及差异，并分别进行茜素红染色及油红O染色以验证多向分化能力，确认获取细胞干性。行免疫荧光染色，对比5组细胞在P3时Ki67染色细胞核所占的比例，并将传代至P5的5组细胞行B-gal染色，观察年龄对于ADSCs活性的影响。　　2.分离培养LSCs，并与ADSCs进行形态学比较，并从增殖分化速度等生长动力学角度对两者进行初步比对以分析差异：参照第一部分实验结果，选择适合的脂肪瘤及脂肪组织块（排除年龄、BMI、基础疾病等干扰因素），以酶消法获取LSCs及ADSCs，对获取的ADSCs行成脂、成骨、成软骨分化实验，行流式细胞术分析其表面标记物表达以再次确认所获细胞为目的细胞;将两者传代培养，观察不同传代期两者形态学差别，以BCIP/NBT染色对比两者干性，以克隆形成单位实验对比二者增殖速度（侧面对比其干性差别）。　　3.通过生物信息学方法来比较LSCs及ADSCs，从而了解与正常脂肪组织相比，脂肪瘤在发生发展过程中起到重要作用的环节：将LSCs及ADSCs进行RNA提取，逆转录，采用基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术对两类样本进行RNA-seq，分析两者基因表达，随后通过对差异表达基因进行GO分析和KEGG信号通路综合分析，从而了解LSCs相较于ADSCs出现变化的生物学进程、细胞组分、分子功能、信号通路等。　　结果：　　1.在倒置显微镜下，通过酶消化法所获取并培养的细胞呈较为饱满的梭形，且随着标本年龄的不断增大，获取细胞逐渐出现扁平化表现，提示有衰老改变。将上述细胞置于成骨培养基培养14d后行茜素红染色，可见典型的钙盐沉积（钙化结节），提示上述细胞已经成骨分化。将细胞置于成脂培养基培养14d，行油红O染色后镜下见细胞内出现大量红染颗粒（脂滴），证实细胞已经成脂分化。多向分化实验证实酶消化法提取的细胞为ADSCs，且ADSCs的分化能力有随着年龄增加而减弱的趋势。对获取细胞进行免疫荧光染色，可发现Ki67红染的具有增殖倾向的细胞核亦有随着标本年龄增大而减少的趋势。B-gal染色也证实，随着年龄增大，衰老细胞占干细胞总数逐渐增多。　　2.实验成功了分离LSCs及ADSCs。在ADSCs三向分化实验中，以甲苯胺蓝染色鉴定加入成软骨培养基的ADSCs，培养3周后可见干细胞出现成软骨分化。流式细胞术检测结果提示CD44、CD73、CD90、CD105等表面标记的表达符合文献所述对于ADSCs的定义。在两者的形态学对比中，刚分离出的基质血管成分(SVF)在LSCs组数目较少，密度低，在ADSCs组数目更多，更密集。在细胞贴壁及其后的传代培养中，LSCs组在形态学上表现为细胞形态不一，大小不均质，而ADSCs组细胞排列更加有序，两者存在明显区别。BCIP/NBT染色结果提示LSCs成骨分化较ADSCs快，但分化细胞的形态与ADSCs表现出明显的差异，提示其分化可能快于正常成骨进程。将两种干细胞置于平板培养，48h后可见LSCs组集落生成更多。　　3.通过行RNA-seq，课题推断在差异表达基因中，LSCs上调的基因主要涉及肿瘤的生长和分化。GO分析结果表明，在LSCs组中，有关细胞生长增殖、胞内活动相关的分子功能、细胞组分和生物学进程的上调基因对比ADSCs有强显著差异，且促瘤因子分泌及细胞抗肿瘤作用等的上调基因亦较ADSCs组有显著差异。KEGG信号通路分析同样提示诸如黏蛋白型O-聚糖等信号通路的相关基因异常上调，亦标示LSCs有向周围组织侵犯的趋势。　　结论：　　通过酶消法获取的目的细胞确为研究所需的脂肪来源干细胞，可稳定传代，有良好的多向分化能力，此类干细胞有随年龄增长逐渐衰老的趋势。将LSCs和ADSCs进行形态学、生长动力学对比，可明显看出LSCs较ADSCs增殖速度快，分化趋势强，但其表现出明显的异型性，增殖、传代、分化的相应细胞也表现出不同程度的异质性。生物信息学比较结果提示LSCs胞内活动更活跃，有更强的增殖、分化水平，并有类似某些恶性肿瘤的转移、侵袭、异常分化、免疫逃逸的表现。参与其中的生物学进程、细胞组分、分子功能、信号通路值得我们在今后的研究中继续深入讨论。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分：ADSCs的分离培养及不同年龄段来源ADSCs增殖分化能力的比较

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二部分LSCs与ADSCs的形态学及增殖分化能力比较

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三部分：LSCs与ADSCs的生物信息学比较

一、实验材料

二、差异表达基因的分析方法

三、实验方法

四、实验结果

五、讨论

全文总结

参考文献

综述

在读期间发表论文和参加科研情况说明

致谢