室旁核内Toll样受体4对颅脑损伤后大鼠交感神经兴奋性的影响及机制研究

摘要

创伤性颅脑损伤(Traumatic Brain Injury, TBI)一直是一个困扰世界的医疗问题，TBI轻重程度往往决定患者的预后情况。重型TBI患者均可出现交感神经兴奋，主要表现为血压、心率和血浆儿荼酚胺水平升高，并引发严重的颅外器官功能障碍，给患者带来不良的临床结局和高昂的医疗支出。目前TBI后发生交感神经兴奋的病理生理学机制尚不清楚，为临床治疗带来极大困难。　　既往研究表明，下丘脑室旁核(The Hypothalamic Paraventricular Nucleus，PVN)是中枢神经系统内调节交感神经活动的关键部位。PVN内的促炎细胞因子水平升高与交感神经兴奋的发生有重要关系。Toll样受体4(Toll Like Receptor4，TLR4)是细胞表面的模式识别受体，能够通过与环境中的配体结合启动细胞内信号通路激活核因子-κB(Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer Of Activated B cells,NF-κB)。激活的NF-κB复合物进入细胞核可以调控TNF-α、IL1-β等多种促炎细胞因子的基因转录，刺激PVN神经元引起交感神经系统兴奋。研究表明，TBI会导致小胶质细胞活化，而中枢神经系统内TLR4主要表达在小胶质细胞上。　　因此本研究提出以下假设:(1)在颅脑损伤后，PVN内活化的小胶质细胞TLR4表达升高;(2) TLR4能够激活下游的NF-κB通路，产生大量TNF-α和IL-1β等炎症因子，改变了PVN内分子环境，导致交感神经兴奋的发生。　　为验证以上假设，本研究拟通过以下实验，(1)利用大鼠液压打击模型，明确血压、心率、心率变异性和血浆去甲肾上腺素的水平，并探索交感神经兴奋随时间的变化规律;(2)选取最佳时间点观察下丘脑PVN内小胶质细胞的活化以及TLR4在小胶质细胞上的共表达情况;并通过PCR、Western blot和免疫组化方法检测PVN内TLR4、NF-κB、TNFα和IL-1β的水平;(3)分别对TLR4进行抑制和激动，明确TLR4与TBI大鼠交感兴奋的关系。探索TBI后TLR4对交感神经兴奋性的调控作用，为TBI后交感兴奋的发病机制提供理论依据和新的治疗靶点。　　第一章 大鼠压液打击模型的建立与交感神经兴奋性检测　　目的:　　建立大鼠颅脑损伤模型，明确TBI后发生交感神经兴奋，并探索交感神经兴奋随时间的变化规律。　　方法:　　70只大鼠麻醉钻孔固定后，经液压打击仪2.1-2.3 ATM压力打击。存活的55只大鼠中，随机选取42只进入血浆去甲肾上腺素实验组，进行各时间点检测;随机选取6只进入心率、平均动脉压和心率变异率实验组，进行各时间点检测;随机选取6只进入脑组织HE染色实验组。随机选取18只平均分配作为各实验组的对照。　　结果:　　1.大鼠液压打击后，死亡率达21.4％神经反射出现不同程度下降或消失。平均呼吸暂停时间(18.62±2.82)s。　　2.液压打击后，颅骨钻孔处脑组织存在部分缺损。HE染色提示脑内各部位均有不同程度的神经元变性、死亡。白质内可见神经的轴突损伤，髓鞘断裂。损伤处大量的神经元死亡及小胶质细胞活化，形成格子细胞。血管与脑组织间隙增加，细胞体积增大。　　3.大鼠心率、平均动脉压、心率变异率及血浆去甲肾上腺素水平，在TBI后24小时开始呈现先升高后降低的变化规律，伤后第3天达到最高值，此时各组均存在统计学差异。　　结论:　　1.液压打击后大鼠的死亡主要原因是呼吸暂停。通过制作大鼠液压打击模型，造成大鼠神经功能下降、神经元变性坏死，创造了脑组织损伤条件。　　2.TBI造成了大鼠交感神经兴奋。TBI后大鼠心率、平均动脉压、心率变异率及血浆去甲肾上腺素等指标随时间变化呈现相似的规律和趋势。　　3.TBI后24小时内大鼠交感神经兴奋性出现升高，然后继续上升至损伤后第3天附近达到最大兴奋程度，随后交感神经兴奋性呈波动下降趋势。　　4.TBI后第3天是交感神经兴奋性研究的最佳时间点。　　第二章 TBI对PVN内小胶质细胞活化及TLR4—NF-κB通路的影响　　目的:　　明确TBI对PVN内小胶质细胞、TLR4、NF-κB和促炎细胞因子的表达影响。　　方法:　　随机选取经液压打击后存活的大鼠24只，作为实验组平均分配至四个亚组进行免疫荧光、免疫组化、Western blot和PCR检测，随机选取24只大鼠作为各亚组的对照。损伤后第72小时断头取脑，免疫荧光检测小胶质细胞Iba-1和TLR4在PVN内及PVN旁组织的共表达情况。PCR检测TLR4在PVN内及PVN旁组织的mRNA水平，以及PVN内TNFα和IL-1β的mRNA水平。Western blot检测NF-κBp65亚基、TNFα和IL-1β的蛋白水平。免疫组化方法检测PVN内及PVN旁组织的NF-κB水平。　　结果:　　1、TBI大鼠PVN内Iba-1、TLR4和NF-κB表达量较对照组增加，差异具有统计学意义。实验组和对照组大鼠的PVN旁组织内TLR4、NF-κB和Iba-1表达水平较低。　　2、TBI大鼠PVN内TNFα和IL-1β的mRNA和蛋白表达水平较对照组升高，差异具有统计学意义。　　结论:　　1、TBI后大鼠PVN内小胶质细胞活化伴随TLR4表达上调、NF-κB、TNF-α和IL1-β含量增加。　　2、大鼠下丘脑PVN是调控交感神经兴奋的关键部位，增加的炎症因子由PVN内产生。　　3、TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平与交感神经兴奋存在相关性。　　第三章 TLR4对TBI大鼠PVN内NF-κB通路及交感神经兴奋性的影响　　目的:　　明确TLR4对PVN内NF-κB促炎细胞因子和交感兴奋的调控作用。　　方法:　　随机选取经液压打击后存活的大鼠60只，TBI与TBI+TAK-242组各30只，每组平均分配至五个亚组进行生命体征、血浆NE、免疫组化、ELISA和PCR检测。随机选取大鼠60只，Control与LPS组各30只，每组平均分配至五个亚组进行生命体征、血浆NE、免疫组化、ELISA和PCR检测。损伤后第72小时断头取脑，处死前24小时分别给予LPS组和TBI+TAK-242组LPS、TAK-242注射。PCR检测TLR4在PVN内的mRNA水平。ELISA检测PVN内TNFα和IL-1β的水平。免疫组化方法检测PVN内的NF-κB水平。　　结果:　　1、应用LPS后，大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平较对照组均有明显升高，差异有统计学意义。TBI大鼠应用TAK-242后TBI大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平有所下降，差异有统计学意义。　　2、应用LPS后，大鼠HR、MAP和血浆NE水平较相应对照组均有明显升高，而SDNN、SDNN Index则明显下降，差异有统计学意义。TBI大鼠应用TAK-242后TBI大鼠HR和血浆NE水平有所下降，差异有统计学意义。　　结论:　　1、TLR4可以通过调控NF-κB和促炎细胞因子水平，调节交感神经兴奋程度。　　2、TBI可通过TLR4调节血压升高，但TLR4的表达可能不是维持血压升高的原因。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 大鼠压液打击模型的建立与交感神经兴奋性检测

一、材料

二、实验方法和步骤

三、统计与分析

四、实验结果

五、讨论

六、结论

第二章 TBI对PVN内小胶质细胞活化及TLR4—NF-κB通路的影响

一、材料

二、实验方法和步骤

三、统计与分析

四、实验结果

五、讨论

六、结论

第三章 TLR4对TBI大鼠PVN内NF-κB通路及交感神经兴奋性的影响

一、材料

二、实验方法和步骤

三、统计与分析

四、实验结果

五、讨论

六、结论

参考文献

综述

致谢