WalK突变导致金黄色葡萄球菌万古霉素敏感性减弱的机制研究

摘要

细胞壁靶向抗生素一般都具有杀菌作用，这与蛋白质合成抑制因子抑菌效果不同。因此，细菌杀伤作用常常伴随着肽聚糖生物合成的抑制及细胞裂解。然而，细菌并没因此保持着对细胞壁靶向抗生素的敏感性，伴随着细菌适应性进化，耐药性发生已成为普遍现象。1950年末，由于产生β-内酰胺酶而对青霉素耐受的金黄色葡萄球菌已广泛出现。1960年初，临床开始引入β-内酰胺酶耐受的苯唑西林，二十年后，苯唑西林耐受金黄色葡萄球菌成为医院获得性感染中常见病原菌，并且MRSA对许多不同类型抗生素都具有耐受性。1997年，万古霉素中度耐受金黄色葡萄球菌被首次发现，随后在美国又发现了万古霉素完全耐受金黄色葡萄球菌。这些耐药菌的发现暗示着广谱耐药性金黄色葡萄球菌存在的可能性。本文主要对万古霉素中度耐受的分子机制进行探究，希望能为新型药物靶标的发现提供理论基础。
　　点突变常常会导致临床菌株的抗生素耐受，然而耐药性发生的分子机制目前仍不清楚。我们利用抗生素筛选获得了万古霉素中度耐受金黄色葡萄球菌，并通过全基因组测序鉴定该菌株的遗传变化，发现二元信号组分WalK(G223D)发生了点突变。我们用walK(G223D)替换野生型MW2中正常walK，发现单点突变的菌株细胞壁代谢相关基因表达下调、自溶活性减弱、细胞壁增厚以及万古霉素敏感性减弱。磷酸化分析实验表明WalK(G223D)自磷酸化能力减弱，进而导致WalR磷酸化水平降低。另外，凝胶迁移实验显示被WalK(G223D)磷酸化的WalR结合atlA启动子能力减弱。综上所述，walK点突变导致WalK(G223D)自磷酸化能力减弱，从而降低了WalR磷酸化水平，低磷酸化WalR结合atlA启动子能力减弱，进而导致atlA表达下调。低水平的atlA表达使得细胞壁代谢速度减慢，因此细菌表现出细胞壁增厚、自溶减弱及万古霉素敏感性减弱。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 金黄色葡萄球菌概述

1．1．1 引言

1．1．2 金黄色葡萄球菌及其危害

1．1．3 金黄色葡萄球菌分子演变

1．1．4 金黄色葡萄球菌致病性分子基础

1．2 细菌应激反应

1．2．1 引言

1．2．2 外界环境产生的细菌应激

1．3 金黄色葡萄球菌β-内酰胺类抗生素抗性

1．3．1 引言

1．3．2 β-内酰胺类抗生素抗性机制

1．4 金黄色葡萄球菌万古霉素抗性

1．4．1 引言

1．4．2 万古霉素杀菌机制

1．4．3 万古霉素耐受金黄色葡萄球菌定义

1．4．4 万古霉素耐受金黄色葡萄球菌表型特征

1．4．5 金黄色葡萄球菌万古霉素耐受分子机制

1．5 金黄色葡萄球菌感染的治疗

1．5．1 万古霉素耐受对治疗结果的影响

1．5．2 万古霉素耐受的治疗方案以及潜在的交叉抗性

1．6 本课题研究内容和目的

1．6．1 引言

1．6．2 金黄色葡萄球菌万古霉素耐受机制研究

第二章 实验材料及方法

2．1 实验菌株和质粒

2．1．1 实验所用质粒

2．1．2 实验所用菌株

2．1．3 实验所用引物

2．2 实验方法

2．2．1 DNA凝胶回收及纯化

2．2．2 大肠杆菌质粒的抽提

2．2．3 大肠杆菌化转感受态的制备和转化

2．2．4 金黄色葡萄球菌基因组DNA和质粒的抽提

2．2．5 金黄色葡萄球菌电转感受态的制备和转化

2．2．6 金黄色葡萄球菌总RNA抽提，mRNA反转录和real-time PCR实验

2．2．7 金黄色葡萄球菌全基因组测序

2．2．8 质粒构建

2．2．9 突变菌株构建

2．2．10 金黄色葡萄球菌相关表型实验

2．2．11 蛋白表达与纯化

2．2．12 蛋白定量与凝胶阻滞分析实验(EMSA)

2．2．13 体外酶活性检测

第三章 实验结果与分析

3．1 万古霉素中度耐受金黄色葡萄球菌的筛选

3．2 全基因组深度测序鉴定SV-1遗传变化

3．3 等位替换菌株构建

3．4 等位替换导致的初步表型变化

3．4．1 WalK(G223D)突变导致万古霉素敏感性减弱

3．4．2 WalK(G223D)和FtsZ(L307V)突变不影响金葡菌生长

3．4．3 WalK(G223D)突变导致细胞壁增厚

3．4．4 WalK(G223D)突变导致金葡菌自溶活性减弱

3．5 WalK突变导致万古霉素敏感性减弱的分子机制研究

3．5．1 WalK(G223D)突变影响了细胞壁代谢相关基因的表达

3．5．2 WalK(G223D)突变导致激酶活性减弱从而降低WalR磷酸化水平

3．5．3 WalK(G223D)减弱了WalR与atlA启动子的结合能力

3．6 总结

第四章 讨论

4．1 万古霉素中度耐受金葡菌机制研究讨论

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果