白背飞虱基因组测序及其受南方水稻黑条矮缩病毒侵染的转录组分析

摘要

白背飞虱是一种重要的农业害虫，主要通过取食植物韧皮部汁液和传播病毒两种方式危害水稻。白背飞虱是目前已知传播南方水稻黑条矮缩病毒(Southernrice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)的特异介体昆虫，SRBSDV在其体内以持久增殖方式扩增。由于缺少白背飞虱的基因组等信息，白背飞虱的相关生物学研究进展缓慢，包括白背飞虱与SRBSDV互作机制的研究。本课题针对这种研究现状，首先对白背飞虱的基因组测序，获得了高质量的基因组序列;系统鉴定了白背飞虱的免疫相关基因;对感染SRBSDV的白背飞虱转录组进行详细的比较分析。结果如下:
　　我们首先对每代白背飞虱进行同胞配对传代，获得基因组杂合度不断降低的近交系。提取F6代个体的基因组DNA，构建一系列插入片段180 bp～40 kb的DNA文库进行高通量测序，获得了总量达到241.3 Gb测序深度为330X的原始序列。经组装和拼接获得约720 Mb的白背飞虱基因组序列，其Contig N50为70.7kb, Scaffold N50为1.18 Mb。生物信息学分析白背飞虱基因组含有21，254个蛋白编码基因。利用64个白背飞虱F1代和F2代个体，构建了23个RAD-seq文库，鉴定发现2，386个遗传标记，构建了15个遗传连锁群。这些连锁群包括529个Scaffolds，占基因组总长度的71％;含13，626个基因，占基因总数的64％。
　　基于白背飞虱基因组和转录组信息，我们通过同源比对分析鉴定了348个免疫相关基因，其中231个基因可以归类至28个免疫基因家族和4个功能组中。为了研究免疫基因在白背飞虱抗SRBSDV过程中的作用以及SRBSDV侵染对白背飞虱产生的影响，我们分析了SRBSDV侵染的白背飞虱转录本。传毒后不同个体SRBSDV S9-2表达水平在第12天和15天有10^6级别的差异。按照白背飞虱个体SRBSDV表达水平分组，提取高病毒滴度组(High viral titers，HVT)、中病毒滴度组(Median viral titers，MVT)和非侵染组(Non-viruliferous，NVF)的白背飞虱RNA进行转录组测序。分析发现SRBSDV侵染对于介体白背飞虱基因表达具有广泛影响。和健康对照组相比，我们在HVT，MVT和NVF组鉴定了278个共同上调表达基因和406个共同下调表达基因（差异倍数＞=2），这些基因参与了很多种生物学过程，在初级代谢通路和氧化还原反应中有一定的富集。鉴于NVF，MVT, HVT组白背飞虱含有SRBSDV渐次增加，分析发现1，906个单向递增基因(Monotonically increasing exprssion genes，MIEGs)和1，467个单向递减基因(Monotonically decreasing exprssion genes，MDEGs)，这些基因表现出一定程度的病毒滴度依赖。RNAi通路基因在MIEGs中显著富集，表明RNAi是白背飞虱抗SRBSDV病毒的一种主要免疫反应。对小RNA分析同样证明白背飞虱RNAi通路在细胞和成虫水平上参与抗SRBSDV反应。
　　综上所述，通过本课题的研究，获得了高质量的白背飞虱基因组序列，明确了白背飞虱的免疫系统组成，认识了白背飞虱在感染SRBSDV后复杂的基因差异表达情况。这些数据和发现为深入研究SRBSDV-白背飞虱-水稻三者之间的互作机制提供了研究基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 白背飞虱概述

1．2 昆虫基因组研究进展

1．3 测序技术概述

1．3．1 文库构建

1．3．2 第一代测序技术

1．3．3 第二代测序技术

1．3．4 第三代测序技术

1．4 昆虫免疫系统和南方水稻黑条矮缩病毒研究进展

1．4．1 昆虫免疫系统概述

1．4．2 昆虫中几种重要的免疫信号通路概述

1．4．3 南方水稻黑条矮缩病毒研究进展

1．4．4 植物病毒与介体昆虫互作研究进展

1．5 总结

第二章 实验材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验所用白背飞虱和水稻

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验常规试剂

2．1．4 试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 白背飞虱饲养

2．2．2 流式细胞仪估算基因组大小

2．2．3 昆虫基因组DNA提取

2．2．4 DNA琼脂糖电泳回收

2．2．5 常规Pair-end DNA文库构建

2．2．6 Mate pair文库构建

2．2．7 白背飞虱基因组组装与蛋白编码基因预测

2．2．8 遗传图谱构建

2．2．9 白背飞虱核糖体RNA去除

2．2．10 转录组文库构建

2．2．11 总RNA提取与反转录

2．2．12 实时荧光定量PCR技术

2．2．13 CaCl2法大肠杆菌感受态细胞制备

2．2．14 白背飞虱传毒实验

2．2．15 白背飞虱细胞系建立、病毒侵染和检测

第三章 结果与讨论

3．1 白背飞虱基因组测序

3．1．1 白背飞虱基因组大小估计

3．1．2 低杂合度白背飞虱群体获得以及基因组文库构建与测序

3．1．3 白背飞虱基因组组装

3．1．4 构建白背飞虱遗传连锁图谱

3．2 白背飞虱免疫系统以及相关基因鉴定

3．2．1 白背飞虱免疫基因鉴定

3．2．2 免疫识别家族

3．2．3 Toll和IMD信号通路

3．2．4 JAK-STAT信号通路和RNA干扰信号通路

3．2．5 黑化反应

3．2．6 抗菌肽等

3．3 白背飞虱与南方水稻黑条矮缩病毒互作分析

3．3．1 南方水稻黑条矮缩病毒侵染白背飞虱病毒滴度存在个体差异

3．3．2 南方水稻黑条矮缩病毒侵染白背飞虱后转录本变化

3．3．3 南方水稻黑条矮缩病毒侵染的白背飞虱细胞免疫和体液免疫受抑制

3．3．4 南方水稻黑条矮缩病毒滴度依赖的白背飞虱差异基因表达分析

3．3．5 RNAi信号通路参与白背飞虱抗病毒免疫反应

3．4 讨论

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文