三岔湖微生物群落结构及其在磷素迁移转化中的作用

摘要

湖泊富营养化已成为全球面临的严峻环境问题之一，严重破坏水生生态系统并危及人类饮用水安全。在外源污染物得到有效控制的条件下，湖泊沉积物中磷的释放是引起水体富营养化的重要因素。目前学者主要集中于浅水湖泊富营养化进程中微生物多样性及环境影响因素等方面研究，而在亚深水型湖泊微生物群落结构及其在磷循环过程中的作用研究较少。三岔湖位于长江水系沱江支流绛溪河上游，是成都天府新区重要饮用水源地，属于内源污染、富营养化的亚深水型湖泊。本文以三岔湖为模式湖泊，运用高通量测序、荧光定量PCR、纯培养和室内静态模拟等技术手段，结合生物统计学分析方法，系统研究了水体和沉积物中微生物群落的结构、多样性和丰度及其对主要环境因子的响应机制，分析其在沉积物-水体界面间磷素迁移转换过程中的功能，以期探讨功能微生物对水体富营养化的贡献，为同类型湖泊富营养化的修复和管理提供理论依据。取得的主要成果如下：　　(1)查明了三岔湖上覆水体和沉积物中磷素形态的时空变化特征。2015~2017年四季上覆水体中总磷(TP)含量的变化范围为0.034~0.227mg·L-1。其中，库尾和湖湾区水体TP含量较高，而主要来水区含量较低。季节分布上，春冬季水体TP含量高而夏秋季低。溶解性总磷(DTP)是TP的重要组成部分。溶解性正磷酸盐(SRP)是DTP的主要组成部分，它们的时空变化特征与TP类似。水体中SRP和TP含量均与叶绿素a(Chla)含量极显著正相关(p＜0.01)，表明磷是三岔湖水体初级生产力的关键限制性营养元素。沉积物中磷素变化特征：TP含量变化范围为0.243~3.774mg·g-1，其含量处于同类型湖泊的上游。原养殖区沉积物TP含量较高，而主要来水区和湖尾区较低。季节分布上，冬秋季沉积物TP高而春夏季低。盐酸磷(HCl-P)是沉积物中磷素的主要成分，有机磷(OP)次之，而氢氧化钠磷(NaOH-P)含量最低。在不同时空采样点，沉积物中有效态磷类别及其对水体磷的贡献呈现不同的变化格局。沉积物磷素的释放是三岔湖水体富营养化的内源污染物。　　(2)基于16SrRNA基因的Miseq高通量测序技术研究了2017年三岔湖春、夏、秋和冬季沉积物中细菌群落的结构组成、多样性及分布特征，结果发现，三岔湖沉积物中细菌物种多样性丰富，获得9,325个OTUs，归属于细菌域的64个门，259个纲，1310个属。其中，Proteobacteria、Actinobacteria和Chloroflexi门为主要类群。Metastats检验表明，Actinobacteria和Chloroflexi2个优势门以及hgcI_clade、Pseudomonas、Sulfuricurvum、Syntrophus、Dechloromonas和Thiobacillus6个优势属的相对丰度季节性变化显著(p＜0.05)。非度量多维标度分析(NMDS)和聚类分析表明，春季和非春季的沉积物细菌群落形成两个明显的特征类群。其中，春季样本类群聚集，而非春季样本类群彼此混杂。Pearson相关性和冗余分析(RDA)表明，溶解氧(DO)、pH值、温度(T)、磷素和总有机碳(TOC)是影响三岔湖沉积物细菌群落结构的主要环境因子。Pearson相关性和线性回归分析表明，沉积物中的优势门(Actinobacteri和Cyanobacteria)、优势纲(Actinobacteria、Cyanobacteria、Flavobacteriia、Alphaproteobacteria和Chloroplast)和优势属(hgcI_clade、Pseudomonas和Thiobacillus)的相对丰度与上覆水SRP含量极显著正相关(p＜0.01)，而优势门Chloroflexi和优势纲Deltaproteobacteria的相对丰度与上覆水SRP含量极显著负相关(p＜0.01)。因此，沉积物细菌类群对水体磷素具有良好的响应，其机制可能与微生物溶磷作用有关。　　(3)2017年三岔湖春、秋季上覆水浮游细菌群落的高通量测序分析显示，三岔湖上覆水体细菌物种多样性丰富，获得9,557个OTUs，归属于细菌域的55个门，64个纲，732个属。其中，Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes门是优势类群。Metastats检验表明，两个季节上覆水具有共同的细菌类群，但部分细菌类群的相对丰度季节性差异显著(p＜0.05或p＜0.01)。Pseudomonas和Bacillus优势属在秋季的相对丰度极显著高于春季(p＜0.01)，这可能是它们对秋季浮游植物茂盛生长引起的缺磷水环境的响应。主成分分析(PCA)和聚类分析表明，春、秋季上覆水浮游细菌群落形成两个明显的分支类群。Pearson相关性和RDA分析表明，三岔湖上覆水体浮游细菌群落结构主要受磷素、高锰酸盐指数(CODMn)、DO和pH值的影响。　　(4)采用高通量测序技术，以碱性磷酸酶(ALP)基因phoD和葡萄糖酸酶(GDH)基因gcd为分子标记，研究了三岔湖沉积物中有机磷溶磷细菌(OPB)和无机磷溶磷细菌(IPB)的多样性、丰度及其对环境因子的响应。结果发现，溶磷细菌的物种多样性丰富，其中Pseudomonas、Streptomyces和Phaeobacter是OPB的优势属，Rhizobiales、Burkholderiales和Pseudomonadales是IPB的优势目。OPB群落在春、秋季的分布差异显著(p＜0.05)，但空间异质性不明显(p＞0.05)。IPB群落在湖湾和主要来水区呈现显著季节性变化(p＜0.05)。pH、DO和上覆水及沉积物的磷素是三岔湖沉积物OPB和IPB细菌群落的关键影响因子。荧光定量PCR分析显示，OPBphoD基因拷贝数在秋季显著高于春季(p＜0.05)，且与上覆水SRP含量显著正相关(p＜0.05)。IPBgcd基因拷贝数在春季高于秋季，两季的gcd基因的拷贝数与上覆水SRP含量显著正相关(p＜0.05)。因此，含phoD和gcd基因溶磷细菌的群落结构和基因拷贝数的变化与上覆水SRP含量变化之间存在时空耦合关系。OPB和IPB可能在三岔湖沉积物-水体界面磷素迁移转化过程中发挥重要的作用。　　(5)采用选择性培养法，从三岔湖沉积物中分离得到具有稳定溶磷活性的细菌共82株，并对其分类学地位进行了初步鉴定。39株OPB分布于5个属，其中Acidovoraxsp.SWWO1711作为OPB鲜见报道。43株IPB分布于9个属，其中CaryophanontenueSWSI1715和RhodococcusaetherivoransSWSI178作为IPB鲜见报道。菌株SWSO1719、SWWO1721、SWSI1728、SWSI1734和SWSI1719为潜在的新分类单元。多相分类研究表明，菌株SWWO1721为Spirosoma属的一个潜在的新种，将其命名为三岔湖螺状菌(Spirosoma lacussanchae sp. nov.)。　　(6)采用液体摇瓶实验和室内静态模拟实验方法研究了分离菌株的溶磷特性。43株IPB能溶解磷酸钙，释放出溶解性磷酸盐(DIP)并使培养液pH值降低。其释磷能力存在差异，释磷量为1.79~102.77mg·L-1。分离菌株溶磷特性受培养液DIP含量和pH值的影响。分离菌株的释磷量与pH值成极显著的负相关曲线关系(p＜0.01)，释磷量符合指数函数的释放特征。大部分IPB菌株培养液投加后，显著促进沉积物中HCl-P的分解和释放(p＜0.05)。39株OPB能溶解卵磷脂，释磷量为0.47~70.91mg·L-1。其溶磷特性受培养液DIP含量和ALP活性相互作用的影响。部分OPB菌株培养液投加后，显著促进沉积物有机磷向无机磷的转化(p＜0.05)。三岔湖溶磷细菌在沉积物磷释放过程中发挥重要作用。　　综上，三岔湖水体富营养化与上覆水和沉积物中微生物在磷循环过程中展现的生态功能相关。三岔湖沉积物中的溶磷微生物资源丰富，其结构组成与环境因子密切相关，在沉积物-水体界面磷的迁移转化过程中发挥重要作用，对水体富营养化有重要贡献。

目录

声明

第 1 章 绪论

1.1 湖泊中的磷循环

1.1.1 富营养化

1.1.2 磷素循环

1.2 湖泊水体和沉积物中磷素形态以及磷释放条件

1.2.1 湖泊水体中磷素形态

1.2.2 湖泊沉积物中磷素形态及其释放条件

1.3 微生物多样性研究方法

1.3.1 传统法

1.3.2 生化成分分析法

1.3.3 现代分子生物学技术

1.4 溶磷细菌的研究进展

1.4.1 溶磷细菌的种类

1.4.2 溶磷细菌溶磷机理

1.4.3 溶磷细菌的分子生物学机制

1.5 三岔湖概况

1.5.1 三岔湖自然社会环境概况

1.5.2 三岔湖总体水质和水体及沉积物磷污染情况

1.6 研究背景

1.7 研究目的、意义和内容

1.7.1 研究目的和意义

1.7.2 研究内容

1.7.3 研究技术路线

第 2 章 实验材料与方法

2.1 采样地点与时间

2.2 水样采集

2.3 水质理化因子分析方法

2.4 沉积物样品采集

2.5 沉积物理化性质分析

2.6 沉积物和上覆水DNA提取

2.7 16S rRNA基因的PCR扩增

2.8 细菌ALP基因phoD PCR扩增

2.9 细菌GDH基因gcd PCR扩增

2.10 Illumina Miseq测序及数据处理分析

2.11 phoD/gcd基因荧光定量PCR

2.11.1 DNA提取和phoD/gcd基因的扩增

2.11.2 标准质粒构建

2.11.3 构建标准曲线

2.11.4 沉积物中phoD/gcd基因的检测

2.12 沉积物中可培养PSB的分离和系统发育分析

2.12.1 培养基

2.12.2 PSB的分离

2.12.3 PSB的系统发育分析

2.13 PSB溶磷能力测定

2.13.1 溶磷圈的测定

2.13.2 液体摇瓶实验

2.13.3 室内静态模拟实验

2.14 1株潜在新种的多项分类研究

2.14.1 菌株来源

2.14.2 培养基

2.14.3 方法

2.15 统计分析

2.16 序列登记号

2.16.1 水体中16S rRNA基因序列登记号

2.16.2 沉积物中phoD/gcd基因和16S rRNA基因序列登记号

第 3 章 三岔湖上覆水和沉积物中磷素的分布特征

3.1 引言

3.2 结果与分析

3.2.1 三岔湖上覆水理化性质和季际变化

3.2.2 三岔湖表层沉积物中不同形态磷素组分的时空分布

3.3 讨论

3.3.1 沉积物磷含量与分布比较

3.3.2 沉积物有效态磷

3.3.3 沉积物中磷赋存形态主要影响因素

3.4 本章小结

第 4 章 三岔湖沉积物中细菌群落结构组成的季节变化与空间分布

4.1 引言

4.2 结果与分析

4.2.1 上覆水和沉积物理化性质

4.2.2 16S rRNA基因V3~V4高变区PCR扩增结果

4.2.3 细菌多样性和丰度

4.2.4 细菌群落分类学组成及时空变化

4.2.5 细菌群落结构比较

4.2.6 沉积物细菌群落与环境理化因子的相关性

4.3 讨论

4.3.1 沉积物细菌多样性及群落组成比较

4.3.2 季节因素对沉积物细菌群落结构影响

4.3.3 沉积物细菌群落结构对环境因子的响应

4.4 本章小结

第 5 章 三岔湖上覆水体浮游细菌多样性和组成时空变化

5.1 引言

5.2 结果与分析

5.2.1 上覆水体的理化性质

5.2.2 16S rRNA基因V3~V4高变区PCR扩增结果

5.2.3 细菌多样性和丰度

5.2.4 细菌群落分类学组成及时空变化

5.2.5 细菌群落组成与结构比较分析

5.2.6 细菌群落与环境理化因子的相关性

5.3 讨论

5.3.1 水体浮游细菌的组成和功能

5.3.2 水体浮游细菌群落分布的主要控制因素

5.3.3 上覆水体与沉积物细菌群落比较

5.4 本章小结

第 6 章 基于高通量测序的三岔湖沉积物溶磷细菌群落结构与时空分布

6.1 引言

6.2 结果与分析

6.2.1 环境样品DNA和phoD及gcd功能基因PCR产物检测

6.2.2 三岔湖沉积物OPB phoD基因的多样性和群落结构分析

6.2.3 三岔湖沉积物IPB gcd基因的多样性和群落结构分析

6.2.4 三岔湖沉积物OPB phoD基因和IPB gcd基因的定量分析

6.2.5 三岔湖沉积物OPB和IPB群落分布与环境因子的相关性

6.3 讨论

6.3.1 沉积物中功能类群和功能基因的组成及环境影响因素

6.3.2 湖泊沉积物功能微生物对富营养化水体有效磷的响应

6.4 本章小结

第 7 章 三岔湖沉积物中可培养溶磷细菌多样性与释磷能力研究

7.1 引言

7.2 结果与分析

7.2.1 溶磷细菌的分离筛选结果

7.2.2 溶磷细菌的鉴定与多样性

7.2.3 溶磷细菌溶磷能力研究

7.2.4 SWWO1721菌株的分类鉴定

7.3 讨论

7.3.1 可培养溶磷细菌多样性

7.3.2 可培养溶磷细菌溶磷特性

7.3.3 传统功能鉴定法和功能基因分子标记法的比较

7.4 本章小结

结论

一、主要结论

二、创新点

三、不足与展望

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文及其他成果