暗紫贝母转录组学分析及分子标记的筛选

摘要

川贝母作为一种珍贵的中药材，是暗紫贝母、卷叶贝母、甘肃贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母的干燥鳞茎，其治疗劳虚咳嗽、吐痰咳血等症状效果显著。由于川贝母价格昂贵，市场需求大，而且多为野生，所以市场上出现了大量的近缘物种混伪品，如平贝母、浙贝母、伊犁贝母等。这些近缘物种与川贝母的形态特征和理化性质较为相似，导致传统的鉴定方法如显微鉴定、理化鉴定和性状鉴定都很难将其区分。与此同时，由于川贝母的基原植物多达6种，不同基原植物的药效又有差别，多基原川贝母的混用易导致临床使用效果不稳定，而目前使用的分子鉴定方法未能将其进行鉴定区分，所以新的特异性分子标记的开发迫在眉睫。本论文采用DNA条形码鉴定及基于暗紫贝母转录组学分析及SSR分子标记等方法对川贝及其混伪品进行鉴定，取得如下结果：　　1.使用《中国药典》方法对12种贝母样品进行分子鉴定，结果显示PCR-RFLP方法仅能将样品分为非酶切组(包括平贝母、浙贝母和伊犁贝母)和酶切组(包括浓密贝母、中华贝母、康定贝母与川贝母)。随后，进一步基于ITS2与psbA-trnH条形码序列，对川贝母及其近缘物种开展分子生物学鉴定与亲缘关系研究，结果发现ITS2序列长度为235~239bp，种内种间平均遗传距离为0.001和0.022，psbA-trnH序列长度为337~373bp，种内及种间平均遗传距离为0.263和0.329。使用ITS2序列和psbA-trnH序列构建系统进化树，前者能将样品分为“南方贝母群”(包括浙贝母、康定贝母、中华贝母、浓密贝母与川贝母)与“北方贝母群”(平贝母和伊犁贝母)。“南方贝母群”又可以分为“川贝母复合群”与浙贝母，其中“川贝母复合群”中的贝母品种有着较近的亲缘关系。而使用psbA-trnH序列构建的系统进化树未能很好的聚类。通过预测ITS2序列的二级结构，发现浙贝母、平贝母与伊犁贝母能被直观的鉴别出来。另外，通过平贝母与伊犁贝母ITS1序列中的特异性片段设计了可以区分出平贝母及伊犁贝母的引物。为分子标记的开发及药用植物的合理应用与有效保护提供了基础。　　2.为了能够筛选出适合川贝母鉴定的特征分子标记，本论文首先开展了暗紫贝母鳞茎组织的二+三代转录组测序。此次测序共得到了28.67Gb的Cleanreads，ROI序列500,419条，全长非嵌合序列359,329条，一致性序列206,653条，最终得到58,474个非冗余序列。通过对暗紫贝母鳞茎组织的转录组数据分析寻找可能参与甾体类生物碱合成途径的基因，并对甾体类生物碱合成途径中的FuMK(甲羟戊酸)基因功能进行研究。首先对FuMK基因进行ORF的克隆并测序，结果表明FuMK基因ORF全长为1,158bp，编码了385个氨基酸；其次生物信息学分析显示，FuMK蛋白为GHMP激酶家族，具有催化甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的功能，是一个没有信号肽、无跨膜结构的疏水性蛋白，克隆得到的FuMK蛋白的序列及所属家族和功能与转录组中的MK基因相同，验证了暗紫贝母鳞茎组织的转录组数据的准确性；另外分子进化树分析结果表明，暗紫贝母的FuMK蛋白与同为百合科的石刁柏处有较近的亲缘关系。本论文首次对暗紫贝母的FuMK基因进行克隆，为下一步研究FuMK基因在暗紫贝母生物碱合成途径中的作用奠定了基础。　　3.为了筛选出有用的SSR标记用于川贝母与近缘物种的鉴定，本研究对转录组数据中的54,479条Unigene进行SSR位搜索，共得到12,343个SSR位点，分布在9,504条Unigene，发生频率为17.14%，出现频率为22.66%，SSR的平均长度为26bp。主要重复类型是单碱基重复，占总SSR的54.39%，三碱基和二碱基重复次之，分别占总SSR的29.89%和14.58%。SSR序列中一共有149种重复基原的类型。根据筛选SSR引物的原则，共筛选出71对SSR引物，首先用这71对引物对12川贝母及其混伪品使用3%的琼脂糖凝胶电泳检测，共有55对引物扩增出了清晰可分辨的条带，其中有35对扩增出与预期长度相同的条带。其次对这35对引物其进行8%聚丙烯酰胺凝胶检测，发现具有多态性的引物12对。最后使用12对多态性SSR引物对12种贝母样品进行遗传多样性分析，结果显示Shannon's信息指数在0.0433~0.2353之间，平均为0.1507。基于SSR标记，利用NTSYS2.10软件进行UPGMA聚类分析，可以将12种贝母样品按南北地域进行区分，将川贝母、暗紫贝母、梭砂贝母、瓦布贝母、甘肃贝母、太白贝母、中华贝母、浓密贝母、康定贝母及浙贝母聚到一起，形成南方贝母群，将伊犁贝母与平贝母分到一起形成北方贝母群。通过多态性SSR引物的琼脂糖凝胶电泳结果进行分析，发现16号引物能够重复多次的在100~250bp之间扩增出暗紫贝母的特异性条带，能对暗紫贝母进行区分，有望开发为暗紫贝母的特异性分子标记。

目录

声明

第1 章绪论

1.1 川贝母

1.1.1 川贝母的简介

1.1.2 川贝母的基原植物及其产地分布

1.1.3 川贝母的化学成分

1.1.4 川贝母的药理作用

1.2 川贝母的鉴别

1.2.1 性状鉴定

1.2.2 显微鉴定

1.2.3 色谱鉴定

1.2.4 光谱鉴定

1.2.5 DNA分子鉴定

1.3药用植物的转录组学研究

1.3.1 功能基因挖掘

1.3.2 发育机制研究

1.3.3 非编码RNA（ncRNA）研究

1.3.4 次生代谢产物生物合成途径及功能基因研究

1.4 SSR分子标记的研究进展

1.4.1 遗传多样性分析

1.4.2 基因定位和目的基因筛选

1.4.3 DNA指纹图谱构建

1.4.4 川贝母SSR 标记研究

1.5 研究目的意义与技术路线

1.5.1研究的目的意义

1.5.2技术路线

第2 章川贝母与近缘种的DNA条形码鉴定

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 试剂

2.2 实验方法

2.2.1 DNA的提取

2.2.2 PCR-RFLP 反应

2.2.3 ITS2和psbA-trnH序列的PCR 扩增

2.2.4 贝母样品的遗传距离图及进化树的绘制

2.2.5 ITS2序列二级结构的预测

2.2.6 ITS1序列的对比设计引物及PCR 扩增

2.3 结果与讨论

2.3.1 DNA的提取及PCR 扩增鉴定结果

2.3.2 PCR-RFLP 反应结果

2.3.3 ITS2与psbA-trnH序列特征及种间、种内遗传距离分析

2.3.4 ITS2序列与psbA-trnH序列NJ进化树分析

2.3.5 ITS2序列二级结构预测

2.3.6 ITS1设计特异性引物PCR 结果与分析

2.4 本章小结

第3 章暗紫贝母三代转录组数据分析

3.1 实验材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 菌种与试剂

3.1.3 培养基

3.2 实验方法

3.2.1 暗紫贝母鳞茎组织RNA提取

3.2.2 文库构建及质检、测序

3.2.3 生物信息学分析

3.2.4 测序数据的统计

3.2.5 可变剪切分析

3.2.6 转录因子分析

3.2.7 lncRNA以及CDS 预测

3.2.8 基因的功能注释以及GO分类

3.2.9 FuMK基因编码区克隆及生物信息学分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 暗紫贝母鳞茎组织RNA提取结果

3.3.2 基于联合测序获得暗紫贝母全长转录本数据的统计分析

3.3.3 可变剪切及转录因子分析

3.3.4 LncRNA及CDS 预测

3.3.5 基于对公共数据检索的功能注释

3.3.6 GO分类

3.3.7 与甾体类生物碱合成有关的基因

3.3.8 FuMK基因的克隆结果

3.3.9 FuMK基因的生物学分析

3.4 本章小结

第4 章暗紫贝母SSR 标记筛选与应用

4.1 实验材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 实验试剂

4.1.3 实验仪器

4.2 研究方法

4.2.1 暗紫贝母转录组测序及SSR 位点筛选

4.2.2 SSR 数据分析

4.2.3 SSR 引物筛选、设计与合成

4.2.4 贝母总DNA提取及质量检测

4.2.5 PCR 扩增反应

4.2.6 PCR 产物的电泳检测

4.2.7 数据统计分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 SSR 位点筛选结果及数据分析

4.3.2 SSR 引物筛选、设计与合成结果

4.3.3 贝母DNA提取及质量检测结果

4.3.4 筛选引物的电泳结果

4.3.5 SSR 标记多态性分析及聚类分析

4.3.6 品种鉴定分析

4.4 本章小结

结 论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文