布氏锥虫蛋白Q38FZ4和Alba的结构和功能研究

摘要

布氏锥虫是一种原生寄生生物，通过采采蝇在哺乳动物间传播，在撒哈拉以南的非洲地区引起人的嗜睡症和牛的那加那病，对人的健康和经济发展带来巨大危害，目前还没有针对锥虫病的有效药物。本论文研究的主要对象是布氏锥虫未知蛋白Q38FZ4和Alba，希望通过对它们结构和功能的研究来为治疗锥虫病开辟新的道路。
　　Q38FZ4是布氏锥虫中一个由85个氨基酸残基构成的可溶蛋白，对血液型和前循环型的锥体虫都十分重要。Q38FZ4与哺乳动物中蛋白的序列同源性非常低，而在动基体目寄生生物中该蛋白具有高度的保守性，是抗锥虫药物的潜在靶点。我们用核磁共振技术解析了Q38FZ4的溶液结构，Q38FZ4蛋白具有一个由3个平行/反平行的β折叠片组成的β折叠片层，和1个斜跨该β片层的长螺旋以及分布在四周的4个小螺旋。我们通过RNA干扰对Q38FZ4进行敲除后，布氏锥虫细胞的生长受到抑制，说明它对布氏锥虫的生长十分重要。在荧光显微镜下，我们观察到带eYFP标签的Q38FZ4蛋白仅在细胞分裂间期定位于溶酶体上。在对带不同标签的Q38FZ4蛋白进行串联亲和纯化实验中，多种溶酶体蛋白和微管相关蛋白被分别纯化出来，说明Q38FZ4参与溶酶体中的物质运输过程。
　　Alba家族蛋白是一类广泛分布在古细菌和众多真核生物中的以二聚体形式存在的核酸结合蛋白。这些蛋白能与核糖体亚基、翻译因子、其他RNA结合蛋白相互作用，通过控制基因的表达来参与各种调节通路。布氏锥虫中鉴定出了4种Alba蛋白，它们是TbAlba1-4。我们得到了TbAlba1的晶体，并收集到了一套分辨率为2.7 A的衍射数据。我们通过GST pull down和ITC实验确定了布氏锥虫Alba蛋白间的相互作用及竞争结合关系。我们还发现TbAlba3和TbAlba4能结合布氏锥虫中特定分子量大小的RNA，而TbAlba1和TbAlba2却无法结合RNA，由此推测TbAlba3-4结合RNA的能力与它们C端的RGG重复序列有关。此外，它们在与TbAlba1或TbAlba2形成异二聚体后结合RNA的范围得到提高。我们用EMSA证实了TbAlba能结合非特异的双链DNA和DNA的G四联体结构，并用ITC测得TbAlba3与DNA的G四联体有较强的结合力，说明TbAlba参与的生物过程不仅只与RNA有关，还涉及到DNA。

目录

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摘要

第一章 布氏锥虫蛋白Q38FZ4的结构和功能研究

1．1 背景介绍

1．1．1 布氏锥虫和锥虫病

1．1．2 布氏锥虫溶酶体

1．1．3 布氏锥虫未知功能蛋白Q38FZ4

1．2．1 序列分析

1．2．2 分子克隆

1．2．3 蛋白的表达与纯化

1．2．4 NMR实验

1．2．5 蛋白核磁结构的解析

1．2．6 细胞系的构建

1．2．7 免疫印迹

1．2．8 RNA干扰实验

1．2．9 荧光显微技术

1．2．10 串联亲和纯化

1．3 实验结果与讨论

1．3．1 序列比对与分析

1．3．2 Q38FZ4的溶液结构

1．3．3 Q38FZ4与相似结构的比较

1．3．4 Q38FZ4对布氏锥虫的生长是必须的

1．3．5 Q38FZ4的细胞定位

1．3．6 Q38FZ4的相互作用蛋白

1．3．7 总结与展望

第二章 布氏锥虫Alba蛋白的结构和功能研究

2．1 背景介绍

2．1．1 Alba蛋白家族

2．1．2 RGG／RG模体简介

2．1．3 布氏锥虫Alba蛋白研究现状

2．2．1 序列分析

2．2．2 分子克隆

2．2．3 蛋白的表达与纯化

2．2．4 蛋白晶体筛选

2．2．5 GSTpulldown

2．2．6 凝胶迁移实验

2．2．7 等温滴定微量热

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 序列比对与分析

2．3．2 Alba蛋白晶体

2．3．3 布氏锥虫Alba相互作用关系

2．3．4 布氏锥虫Alba与核酸的结合

2．3．5 总结与展望

参考文献

附录

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果